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BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato PCR Y SECUENCIACIÓN DE ADN BIOTECNOLOGÍA 2º bachillerato.

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1 BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato PCR Y SECUENCIACIÓN DE ADN BIOTECNOLOGÍA 2º bachillerato

2 BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN Generalmente las muestras suelen ser pequeñas ADNs antiguos (Mamut) ADNs escena crimen ADNs embrionarias ADN genes virales se necesita AMPLIFICACIÓN mediante TÉCNICA DE LA PCR es Es un proceso repetitivo (desnaturalización, hibridación, extensión) del que se obtienen muchas copias de un mismo fragmento de ADN (polymerase chain reaction)

3 BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato TÉCNICA DE LA PCR Materiales Muestra de ADN Cebador (P1 y P2) Fuente de calor Taq polimerasa (resistencia al calor) 1.Desnaturalización por calor. 2.Hibridación con el cebador. 3.Extensión de la cadena complementaria por Taq polimerasa.

4 BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato Una vez que se tiene cantidad suficiente de ADN… SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN Método del didesoxi para fragmentos no muy grandes (fragmentos de unos 800 pb) MATERIALES Una opción es que cada didesoxinucleótido tenga una marca fluorescencia de color diferente. (otra posibilidad es hacer electroforesis en pozos separados) Cuando un didesoxinucleótido se une a la cadena en extensión se detiene la síntesis ya que no se puede unir el siguiente nucleótido al C3 sin OH

5 BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato MÉTODO DEL DIDESOXI Una vez que se tienen todos los materiales y el ADN desnaturalizado, se inicia la síntesis de la hebra complementaria. Una vez terminada se vuelve a desnaturalizar. Se presenta lo que sucede a los fragmentos que terminan, por ejemplo, en ddA, es decir, localizan la posición de una T en el ADN a secuenciar. En algunos ADNs, la ddA se unirá a la primera T que aparece, deteniéndose ahí la síntesis. Será un fragmento pequeño. Las tres cadenas de ADN son iguales (obtenidas mediante PCR) Se obtienen hebras de ADN de diferente longitud, todas ellas terminadas en A. Eso indica que en esa posición había una T en el ADN a secuenciar. (lo mismo con ddT, ddA, ddC y ddG) (en ese tubo de ensayo sólo habría ddA)

6 BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato MÉTODO DEL DIDESOXI Fragmentos obtenidos según ADN a secuenciar ¿Cómo se separan los diferentes fragmentos que Están en el tubo de ensayo? Por ELECTROFORESIS en GEL de acrilamida Cuatro pozillos diferentes en la electroforesis Un solo pozillo (Los fragmentos más pequeños se desplazan más)

7 BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato MÉTODO DEL DIDESOXI En el Proyecto Genoma se utilizaron métodos basados en este sistema pero con algunas diferencias y, sobre todo, ordenadores muy potentes.


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