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Microbiología II Tema Prueba de ELISA OBJETIVO Conocer la técnica de ELISA, su fundamento y algunas aplicaciones en particular para la detección del virus.

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1 Microbiología II Tema Prueba de ELISA OBJETIVO Conocer la técnica de ELISA, su fundamento y algunas aplicaciones en particular para la detección del virus de sida por medio de esta técnica.

2 Breve repaso de anticuerpos y antígenos. El sistema inmune de los mamíferos evoluciono para reconocer y destruir la variedad de patógenos (y sus variaciones antigénicas) a lo que los organismos deben enfrentarse a lo largo de la vida. El sistema inmune de los mamíferos evoluciono para reconocer y destruir la variedad de patógenos (y sus variaciones antigénicas) a lo que los organismos deben enfrentarse a lo largo de la vida. Los elementos básicos de este reconocimiento lo constituyen los linfocitos B y T, y las células presentadoras de antigéno: los dos primeros evolucionaron de forma tal que sus receptores para antigenos pueden reconocer de manera específica virtualmente cualquier molécula biológica. Los elementos básicos de este reconocimiento lo constituyen los linfocitos B y T, y las células presentadoras de antigéno: los dos primeros evolucionaron de forma tal que sus receptores para antigenos pueden reconocer de manera específica virtualmente cualquier molécula biológica. Inmunización es un proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo competente desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un antígeno. Inmunización es un proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo competente desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un antígeno.

3 Antecedentes de la técnica Antecedentes de la técnica La detección de la reacción antigéno- anticuerpo. La detección de la reacción antigéno- anticuerpo. Método sencillo, de alta sensibilidad y especifico, con posibilidad de ser automatizados y pueden ser realizados en laboratorios sin grandes recursos técnicos. Método sencillo, de alta sensibilidad y especifico, con posibilidad de ser automatizados y pueden ser realizados en laboratorios sin grandes recursos técnicos. Dentro de los factores que han propiciado la expansión de este método se encuentra: Dentro de los factores que han propiciado la expansión de este método se encuentra: El desarrollo de la industria del plástico, que género materiales con características de adsorción definidas y reproducibles. El desarrollo de la industria del plástico, que género materiales con características de adsorción definidas y reproducibles. Las características y desarrollo de métodos de purificación de las enzimas que se emplean como marcadores. Las características y desarrollo de métodos de purificación de las enzimas que se emplean como marcadores. el desarrollo de métodos más sencillos y confiables de conjugación de anticuerpos a las enzimas marcadores el desarrollo de métodos más sencillos y confiables de conjugación de anticuerpos a las enzimas marcadores

4 Principio de la técnica (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman. (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman. Método que utilizan los anticuerpos conjugados con una enzima, conserva su capacidad de unión especifica al antígeno al antígeno. Método que utilizan los anticuerpos conjugados con una enzima, conserva su capacidad de unión especifica al antígeno al antígeno. La enzima es capaz de una reacción de oxido- reducción. La enzima es capaz de una reacción de oxido- reducción. EL sustrato se transforma en un producto colorido. EL sustrato se transforma en un producto colorido.

5 Descripción de la técnica. El ensayo inmunoadsorbido ligado a enzima (ELISA), técnicas serologías más utilizada. El ensayo inmunoadsorbido ligado a enzima (ELISA), técnicas serologías más utilizada. Hay dos métodos básicos: Hay dos métodos básicos: La técnica de sándwich de doble anticuerpo. La técnica de sándwich de doble anticuerpo. Ensayo indirecto inmunoadsorbido ligado a enzima para la detección de anticuerpos. Ensayo indirecto inmunoadsorbido ligado a enzima para la detección de anticuerpos.

6 Método del sándwich de doble anticuerpo. Adsorciòn del antisuero a la superficie de los posillos de una placa de microtitulación. Adsorciòn del antisuero a la superficie de los posillos de una placa de microtitulación. El antigéno se añade y reacciona específicamente con los anticuerpos adsorbidos a los posillos, el antigéno será retenido a pesar de los lavados que se realicen para eliminar el antigéno libre. El antigéno se añade y reacciona específicamente con los anticuerpos adsorbidos a los posillos, el antigéno será retenido a pesar de los lavados que se realicen para eliminar el antigéno libre. Anticuerpo específico para el antigéno, el segundo anticuerpo, para el antigéno. Anticuerpo específico para el antigéno, el segundo anticuerpo, para el antigéno. Sándwich. Sándwich. Con el antigéno entre las dos moléculas del anticuerpo. Con el antigéno entre las dos moléculas del anticuerpo. Es visible el segundo anticuerpo añadido está unido a una enzima. Es visible el segundo anticuerpo añadido está unido a una enzima. Peroxidasa de rábano Peroxidasa de rábano Fosfatasa alcalina. Fosfatasa alcalina. La actividad enzimática se pone de manifiesto por un cambio de color, negativo ya que todo el antígeno no unido se elimina al lavar. La actividad enzimática se pone de manifiesto por un cambio de color, negativo ya que todo el antígeno no unido se elimina al lavar.

7 Ensayo indirecto inmunoadsorbido. En el primer paso de este método se adsorbe el antígeno, En el primer paso de este método se adsorbe el antígeno, Anticuerpos, a las paredes de la placa. Anticuerpos, a las paredes de la placa. Muestra de un suero contiene anticuerpos frente a este antigéno se añade el antisuero a los posillos. se lava y se añade entonces anti-Ig humana (un anticuerpo que reacciona con cualquier inmunoglobulina humana), que se unirá al complejo antígeno-anticuerpo. Muestra de un suero contiene anticuerpos frente a este antigéno se añade el antisuero a los posillos. se lava y se añade entonces anti-Ig humana (un anticuerpo que reacciona con cualquier inmunoglobulina humana), que se unirá al complejo antígeno-anticuerpo. La antiIg humanan. que no se ha fijado es lavada y se añade entonces el sustrato adecuado para la enzima. La antiIg humanan. que no se ha fijado es lavada y se añade entonces el sustrato adecuado para la enzima.

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9 Algunas aplicaciones de la técnica. Determinación de la tirosina. Determinación de la tirosina. Digoxina, B- metildigoxina, alfa acetilcolina; B – acetildigoxina. Digoxina, B- metildigoxina, alfa acetilcolina; B – acetildigoxina. Insulina. Insulina. Alfa -1-fetoproteina. Alfa -1-fetoproteina. Tiroxina serica. Tiroxina serica. Tridoyotironina. Tridoyotironina.

10 El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha hecho posible por primera vez el diagnostico de enfermedades de transmisión sexual producidas por clamidias. El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha hecho posible por primera vez el diagnostico de enfermedades de transmisión sexual producidas por clamidias. El uso de sondas de DNA, aunque no sean pruebas serológicas, resultará cada vez más útil para la detección de patógenos en tejidos o alimentos. El uso de sondas de DNA, aunque no sean pruebas serológicas, resultará cada vez más útil para la detección de patógenos en tejidos o alimentos.

11 Introducción hacia el SIDA Bacterias, hongos y virus muy comunes que ordinariamente no ocasionan enfermedad. Bacterias, hongos y virus muy comunes que ordinariamente no ocasionan enfermedad. VIH. VIH. Sangre, esperma, saliva, lágrimas, tejido nervioso, leche materna, y secreciones del tracto genital. Sangre, esperma, saliva, lágrimas, tejido nervioso, leche materna, y secreciones del tracto genital. La transmisión: contacto sexual incluyendo el sexo anal, vaginal y oral; por medio de la sangre mediante transfusiones o aguja infectada; y en mujeres embarazadas al feto, o al dar de mamar al bebé. La transmisión: contacto sexual incluyendo el sexo anal, vaginal y oral; por medio de la sangre mediante transfusiones o aguja infectada; y en mujeres embarazadas al feto, o al dar de mamar al bebé. Métodos mas raros de transmisión incluyen el pinchazo accidental con una aguja, la inseminación artificial, en la que la transmisión ocurre a través del esperma donado, y el transplante de riñón, en el que el transmisor es el riñón donado. Métodos mas raros de transmisión incluyen el pinchazo accidental con una aguja, la inseminación artificial, en la que la transmisión ocurre a través del esperma donado, y el transplante de riñón, en el que el transmisor es el riñón donado.

12 El virus (VIH) es un retrovirus, que presenta hebras de ARN y una enzima, la transcriptasa reversa. Posee, además, una proteína específica, la GP120, membranolítica en su capa externa, que le ayuda a perforar la membrana de la célula atacada y penetrar en ella. En el caso del VIH la célula parasitada es el linfocito T4. El virus (VIH) es un retrovirus, que presenta hebras de ARN y una enzima, la transcriptasa reversa. Posee, además, una proteína específica, la GP120, membranolítica en su capa externa, que le ayuda a perforar la membrana de la célula atacada y penetrar en ella. En el caso del VIH la célula parasitada es el linfocito T4.

13 Retrovirus del Sida por el linfocito T4 se debe a que éste presenta en su superficie un marcador específico que le permite al virus reconocerlo. Retrovirus del Sida por el linfocito T4 se debe a que éste presenta en su superficie un marcador específico que le permite al virus reconocerlo. El proceso posterior a la invasión es el típico de infección por virus: transcripción de su genoma al ADN del huésped, obligando a éste a réplicas sucesivas hasta destruirlo, saliendo luego un gran número de individuos a parasitar a otros linfocitos T4. El proceso posterior a la invasión es el típico de infección por virus: transcripción de su genoma al ADN del huésped, obligando a éste a réplicas sucesivas hasta destruirlo, saliendo luego un gran número de individuos a parasitar a otros linfocitos T4.

14 Copia la información genética de él mismo, de modo que pueda integrarse en el propio código genético de la célula huésped, lo que hace que cada vez que se divida, una célula huésped, se reproducirán copias virales, cada una de ellas con el código viral. Copia la información genética de él mismo, de modo que pueda integrarse en el propio código genético de la célula huésped, lo que hace que cada vez que se divida, una célula huésped, se reproducirán copias virales, cada una de ellas con el código viral.

15 Aplicación de la técnica de ELISA, para la diagnosticación del SIDA

16 Elaboro: Cruz Cruz Ma. Candelaria. Bibliografía Albert L. Lehninger, PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA, 2 ed., ediciones Omega, España, 1995 (pag 145). Albert L. Lehninger, PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA, 2 ed., ediciones Omega, España, 1995 (pag 145). Gerard J. Tortora, INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÌA, editorial Arribia, S.A, España, 1993 (pag ). Gerard J. Tortora, INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÌA, editorial Arribia, S.A, España, 1993 (pag ). Aldo A. Guerci, LABORATORIO METODOS DE ANALISIS, 4 ed, editorial Librería el Ateneo, Argentina, 1988 (pag ). Aldo A. Guerci, LABORATORIO METODOS DE ANALISIS, 4 ed, editorial Librería el Ateneo, Argentina, 1988 (pag ). Jorge V. Gavilondo Cowley, ANTICUERPOS MONOCLONALES, editorial Elfos, México, 1995 (pag 71-76, ). Jorge V. Gavilondo Cowley, ANTICUERPOS MONOCLONALES, editorial Elfos, México, 1995 (pag 71-76, ). Vicente T. Devita, SIDA, 2ª, editorial Salvat editores, S.A España, 1990 (pag ). Vicente T. Devita, SIDA, 2ª, editorial Salvat editores, S.A España, 1990 (pag ).


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