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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA EVALUACIÓN DE BIOAEROSOLES, BACTERIAS Y HONGOS, EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – BIOTECNOLOGÍA.

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1 DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA EVALUACIÓN DE BIOAEROSOLES, BACTERIAS Y HONGOS, EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – BIOTECNOLOGÍA DE LA ESPE Y CONSTRUCCIÓN PREVIA DE UN MUESTREADOR DE BURBUJEO EXPERIMENTAL. Tesista: Andrés López M. Directora: M. Sc. Alma Koch Codirector: Ing. Mat. Pedro Romero

2 I. INTRODUCCIÓN Problemática Conjunto de partículas en suspensión de origen biológico variable en un medio gaseoso Tamaño Trabajadores 0,001 – 1 µm 1 – 5 µm 5 – 10 µm Fuentes Asociados a Enfermedades Rol ecológico Bioaerosoles

3 2. Objetivos de la Investigación Objetivo General Evaluar los bioaerosoles (bacterias y hongos) en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE y construir previamente un muestreador de burbujeo experimental. Objetivos Específicos 1.Determinar la existencia de bioaerosoles. 2.Establecer las posibles fuentes de emisión de bioaerosoles. 3.Evaluar tareas y puestos de trabajo y su relación con los bioaerosoles. 4.Construir un muestreador de burbujeo experimental en base al diseño de Agranovski et al. (2002). 5.Tomar muestras de bioaerosoles con el muestreador de burbujeo experimental (Agranovski et al., 2002). 6.Identificar las muestras de bioaerosoles recolectadas usando técnicas de cultivo convencionales. 7.Cuantificar la concentración de bioaerosoles. 8.Documentar la presencia de bioaerosoles. I. INTRODUCCIÓN

4 3. Hipótesis Hipótesis nula La presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE no es significativa. Hipótesis alternativa La presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE es significativa. I. INTRODUCCIÓN

5 II. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Participantes Tesista: Andrés López M. Directora: M. Sc. Alma Koch Codirector: Ing. Mat. Pedro Romero Personal del Laboratorio Estudiantes Centro de Investigaciones Científicas (CEINCI) de la ESPE 2. Zona de Estudio Investigación de campo y análisis de laboratorio: Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE (constituido por tres áreas). Área de Investigaciones Área de Docencia Área de Biología Molecular

6 Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE. Área de Investigaciones, Área A. Área aproximada de 30,16 m 2 II. MATERIALES Y MÉTODOS

7 Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE. Área de Docencia, Área B. Área aproximada de 53,65 m 2 II. MATERIALES Y MÉTODOS

8 Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE. Área de Biología Molecular, Área C. Área aproximada de 46,34 m 2 II. MATERIALES Y MÉTODOS

9 3. Diseño experimental (Gutiérrez & De La Vara, 2008). Diseño de bloques completos al azar (DBCA) Arreglo de los datos en el DBCA para la investigación Modelo estadístico Hipótesis Número de tratamientos 3 áreas x 3 días x duplicado = 18 Pruebas LSD de Fisher Shapiro Wilks Levene Independencia II. MATERIALES Y MÉTODOS

10 4. Procedimientos Construcción del muestreador experimental De acuerdo al diseño de Agranovski et al. (2002), con modificaciones Inspección detallada del edificio Inspección exterior Inspección interior Descripción de actividades del área de trabajo Identificar los posibles mecanismos de propagación de bioaerosoles Identificación de los bioaerosoles muestreados Mediante técnicas de Microbiología tradicional Bacterias (Género y especie) Hongos (Género) Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) De acuerdo a la norma NIOSH 0800 Bioerosols Sampling, con modificaciones Determinación de las concentraciones de bioaerosoles Partículas totales Bioaerosoles viables y no viables UFC/m 3 II. MATERIALES Y MÉTODOS

11 4.1. Construcción del muestreador experimental Esquema del muestreador: (a) vista tridimensional y vista lateral, y (b) vista de planta (Agranovski, Agranovski, Reponen, Willeke, & Grinshpun, 2002) Muestreadores experimentales construidos Material de construcción Acrílico Material de construcción PVC Diseño II. MATERIALES Y MÉTODOS (b)

12 4.1. Construcción del muestreador experimental Producción de burbujas para fotografías (Agranovski, Braddock, & Myojo, 1999) Absorción de aerosoles en burbujeo Circulación de aire en el interior de la burbuja Deposición inercial Sedimentación Difusión Principio de funcionamiento Muestreador en funcionamiento II. MATERIALES Y MÉTODOS

13 4.2. Inspección detallada del edificio (exterior e interior) 4.3. Descripción de actividades del área de trabajo II. MATERIALES Y MÉTODOS Registro de inspección exterior e interior Registro de actividades durante la evaluación

14 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Tipos de bioaerosoles a muestrear Bacterias y hongos Puntos de muestreo 2 puntos de muestreo por cada área Número de muestras 3 áreas x 3 días x duplicado = 18 Tiempo y flujo de muestreo 8 h continuas diarias 4 L/min Temperatura, humedad relativa y presión atmosférica Fluido de recolección Tripticase Soy Broth (TSB) Medios de cultivo Bacterias Tripticase Soy Agar (TSA) con 0,04% de actidiona Hongos Malt Extract Agar (MEA) con 0,01% de cloranfenicol II. MATERIALES Y MÉTODOS Registro muestreo de bioaerosoles

15 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Limpieza y desinfección del equipo muestreador LimpiezaDesinfección Preparación de los equipos muestreadores Relleno del dispositivo muestreador de bioaerosoles con 40 mL de medio TSB mediante un dosificador Equipos muestreadores B1, B2 y B3 con 40 mL de medio TSB listos Equipos muestreadores sellados y listos II. MATERIALES Y MÉTODOS

16 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Equipos muestreadores B1, B2 y B3 Bombas de succión de aire Puntos de muestreo en área A Uso del equipo muestreador In situ II. MATERIALES Y MÉTODOS

17 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Uso del equipo muestreador In situ Equipos muestreadores B1, B2 y B3 Bombas de succión de aire Puntos de muestreo en área B II. MATERIALES Y MÉTODOS

18 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Equipos muestreadores B1, B2 y B3 Bombas de succión de aire Puntos de muestreo en área C Uso del equipo muestreador In situ II. MATERIALES Y MÉTODOS

19 Procesamiento de las muestras de bioaerosoles 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Enjuague y recuperación Volumen final (80 mL) División en alícuotas (40 mL) Equipos al finalizar la toma de muestras Refrigeración II. MATERIALES Y MÉTODOS

20 4.5. Determinación de las concentraciones de bioaerosoles Recuento total de partículas biológicas y no biológicas Recuento de bioaerosoles viables y no viables Conteo en la Cámara de Neubauer Diluciones seriadas (10 -1 y ) y cultivo en medios MEA y TSA II. MATERIALES Y MÉTODOS

21 UFC/m 3 de aire 4.5. Determinación de las concentraciones de bioaerosoles Corrección de las mediciones observadas (Agranovski, Agranovski, Reponen, Willeke, & Grinshpun, 2002) (TULAS, 2011) II. MATERIALES Y MÉTODOS

22 4.6. Identificación de los bioaerosoles muestreados Aislamiento de bioaerosoles (bacterias y hongos) Medios de cultivo Bacterias Tripticase Soy Agar (TSA) con 0,04% de actidiona Hongos Malt Extract Agar (MEA) con 0,01% de cloranfenicol Algunas bacterias y hongos Potato Dextrose Agar (PDA) Evaluación morfológica, se escogieron las colonias distintas Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos) II. MATERIALES Y MÉTODOS

23 4.6. Identificación de los bioaerosoles muestreados Tinción Gram Prueba de la Catalasa Prueba de Oxidasa Evaluación macroscópica Evaluación microscópica Técnica del celo Tinción de KOH y azul de metileno modificada Tinción Gram Determinación del género Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 2001 Bacterias Hongos Software Identax Bacterial identification System II. MATERIALES Y MÉTODOS

24 III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Construcción previa del muestreador de burbujeo experimental Equipos muestreadores B1, B2 y B3 (Agranovski et al., 2002) construidos para la Evaluación de Bioaerosoles (bacterias y hongos)

25 2. Inspecciones exterior e interior del edificio Buenas condiciones, Poco polvo No había evidencias visibles de fuentes microbianas, nutrientes o agua. No existen sistemas de ventilación o filtración de aire La infraestructura física (pisos, mesas de trabajo, ventanas) no cumplen con los requerimientos adecuados para un laboratorio de Microbiología. Área B III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Interior Exterior

26 Área A 3. Actividades en el entorno de trabajo Área B III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

27 Área C 3. Actividades en el entorno de trabajo Acciones comunes Movimiento del aire generado por Caminar Hablar Toser Estornudar Reaerolización de partículas del piso y de las superficies Fuentes: Bacterias aire interior, ocupación humana, sus actividades Hongos aire exterior, plantas, suelo III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

28 4. Temperatura, humedad relativa y presión atmosférica Aumento temperatura Recuentos elevados de microorganismos y esporas de hongos en el aire Humedad relativa interior Desecación puede conducir a la pérdida de viabilidad III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

29 5. Recuento total de partículas biológicas y no biológicas Observación de dos partículas (posibles bioaerosoles), III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

30 6. Recuento de bioaerosoles viables y no viables Conteo de bioaerosoles (bacterias y hongos) viables en el contador de colonias Quebec III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

31 7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m 3 Bacterias y hongos ANOVA (p<0,05) Límites permisibles sugeridos Holanda UFC/m 3 III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

32 Bacterias ANOVA (p<0,05) 7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m 3 Límites permisibles sugeridos Unión Europea UFC/m 3 OMS 500 UFC/m 3 III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

33 Hongos ANOVA (p<0,05) 7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m 3 Límites permisibles sugeridos Unión Europea UFC/m 3 III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

34 Selección de dos colonias distintas de bioaerosoles (bacterias), 8. Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos) III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

35 Selección de una colonia distinta de bioaerosoles (bacterias resistentes al cloranfenicol), Selección de la colonia del bioaerosol hongo, 8. Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos) III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

36 9. Aislamiento de bioaerosoles (bacterias y hongos) Medio TSA Medio MEA Medio PDA III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

37 10. Identificación de los bioaerosoles bacterias Catalasa Oxidasa Tinción Gram Pruebas bioquímicas Antibiograma III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Identax

38 10. Identificación de los bioaerosoles hongos Tinción de KOH y azul de metileno Tinción Gram Tinción de Azul de Lactofenol Técnica del celo (cinta adhesiva) Bacterias resistentes al cloranfenicol Hongo filamentoso III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

39 11. Localización de los bioaerosoles encontrados Área de Investigaciones III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 8 bacterias 7 especies

40 11. Localización de los bioaerosoles encontrados Área de Docencia III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 15 bacterias 1 hongo 11 especies 1 género

41 11. Localización de los bioaerosoles encontrados Área de Biología Molecular III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 18 bacterias 16 especies

42 IV. CONCLUSIONES Las posibles fuentes de emisión de los bioaerosoles encontrados fueron el movimiento del aire generado por las personas al caminar, al hablar, toser, estornudar, la reaerolización de partículas del piso y de las superficies y también el aire proveniente del ambiente exterior. Se analizaron las tareas y puestos de trabajo durante la evaluación de bioaerosoles y se descubrió que la apertura y cierre de puertas constituye la acción predominante que probablemente permite la proliferación de los bioaerosoles, además de la presencia de seres humanos, otras actividades y el aire exterior. La viabilidad de los bioaerosoles en las tres áreas analizadas se mantuvo entre 0,654% y 2,386% y los factores principales que posiblemente los afectaron son la humedad y la temperatura ambiental durante la evaluación. El área de Biología Molecular registró la mayor concentración de bioaerosoles, la de Docencia mostró una concentración intermedia y la de Investigaciones reveló la menor concentración.

43 Se evidenció que casi todas las concentraciones de bioaerosoles detectadas excedieron los límites sugeridos por la Organización Mundial de la Salud, la Unión Europea, y Holanda. De las tres áreas del Laboratorio de Microbiología - Biotecnología se aislaron 42 bioaerosoles (41 bacterias y 1 hongo), 38 bioaerosoles bacterias fueron bacilos Gram negativos, mientras que 3 fueron bacilos Gram positivos, de igual manera se halló un sólo bioaerosol hongo filamentoso. Los bioaerosoles bacterias fueron predominantes sobre los hongos. Sobre los géneros de bioaerosoles descubiertos se obtuvo que 2 son de Enterobacter, 3 de Yersinia, 1 de Serratia, 5 de Ewingella, 4 de Burkholderia, 1 de Klebsiella, 2 de Proteus, 19 de Pseudomonas, 1 de Hafnia, 3 de Bacillus y 1 de Alternaria spp. Se comprobó que la presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos, en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE es significativa. IV. CONCLUSIONES

44 V. RECOMENDACIONES Se debería: Ampliar la información sobre bioaerosoles en el Ecuador realizando nuevas investigaciones en otros ambientes laborales. Investigar los bioaerosoles recolectados ya que algunos tienen diversas aplicaciones. Incrementar la concentración del agente antibacteriano cloranfenicol en el medio de cultivo MEA o utilizar otras alternativas. Extender el número de muestras y la inversión económica para mejorar la inferencia estadística. Implementar algún sistema de control de bioaerosoles para disminuir sus concentraciones en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE. Rediseñar y adecuar las instalaciones del Laboratorio de Microbiología – Biotecnología de la ESPE para lograr un eficiente desarrollo de sus actividades.

45 AGRADECIMIENTOS A la Escuela Superior Politécnica del Ejército por el apoyo y recursos brindados. A mi querida madre Sarita, que me enseñó, apoyó y respaldó mis anhelos y sueños para convertirme en el ser humano que soy. A todos esos dilectos amigos y amigas de mi madre, que se preocuparon y me apoyaron para que culmine con éxito mi estudio. A M. Sc. Almita Koch Kaiser y al Ing.-Mat. Pedro Romero, Directora y Codirector de mi Tesis, por su acogida, respaldo y conocimientos brindados. A Ing. Jessie Maisincho y la Dra. Ligia Ayala por su apoyo y colaboración. A mis apreciados amigos y amigas.


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