La descarga está en progreso. Por favor, espere

La descarga está en progreso. Por favor, espere

GK-07. Calor Microondas UV radiación Agitación fuerte Detergentes Metales pesados Solvente orgánicos Ácidos y bases fuertes Sales > Temperatura > pH >

Presentaciones similares


Presentación del tema: "GK-07. Calor Microondas UV radiación Agitación fuerte Detergentes Metales pesados Solvente orgánicos Ácidos y bases fuertes Sales > Temperatura > pH >"— Transcripción de la presentación:

1 GK-07

2 Calor Microondas UV radiación Agitación fuerte Detergentes Metales pesados Solvente orgánicos Ácidos y bases fuertes Sales > Temperatura > pH > detergente > sustancias solubles en agua efecto de DENATURACION de PROTEINAS

3 Preparación de proteínas factoratención durante la preparación temperatura evitar alta temperatura, dejar en HIELO congelar-descongelardeterminar el efecto de congelar, agregar glicerol al tampón, guardar alicuotado denaturación física no agitar, usar vortex vigorosamente mezclar, nunca introducir burbujas efecto de dilución oxidación metales pesados crecimiento de bacterias proteasas mantener conc. > 1mg/ml incluir 0,1 – 1mM DTT en el tampon incluir 1 – 10mM EDTA en el tampon utilizar soluciones estériles, incluir anti-microbianos, y/o congelar incluir inhibidores de proteasas, mantener en HIELO

4 PURIFICACION DE PROTEINAS - necesario para revelar su estructura - desarrollo de inhibidores - desarrollo de vacunas - aislar proteínas recombinantes para vacunas -- etc...

5 Vacuna de proteína recombinante Vacas clonadas y geneticamente modificada produce proteína en su leche (Alan Trounson, Australia) Taste receptors Diseño de drogas

6 Estrategia de purificación de proteínas - selección del tejido - homogenización - clarificación – precipitación - solubilización y PURIFICACIÓN - captura - purificación mediana pureza - purificación, ultra pureza necesario test para monitorear ej. detección inmunológica o test funcional

7 John Kendrew, mioglobina, Max Perutz, hemoglobina

8 Cachalote (Physeter catodon) 17,8 kDa

9

10 Rayos X, desviación, reconstrucción de la desviación,

11 Localización de los átomos

12 Ej: A el Partenon; B es un esquema de difracción del Partenon, C y D imágenes reconstruidas con los datos de B.

13 Revelar ESTRUCTURA NATIVA (terciaria) FUNCION Para obtener cristales proteína pura

14 Proteína, Purificación -Fraccionamiento celular -Centrifugación -Cromatografía intercambio iónico, carga, depende del pH -Cromatografía exclusión por tamaño -Cromatografía de afinidad, ligando de la proteína a un bead, selectivo, unión proteina-proteina

15

16 Fraccionamiento celular

17 TIPOS DE CENTRÍFUGAS SECCIÓN DE UNA CENTRÍFUGA PREPARATIVA DE BAJA VELOCIDAD MICRÓFUGA DE ALTA VELOCIDADULTRACENTRÍFUGA

18 TIPOS DE ROTORES ROTORES FLOTANTES ROTORES DE ÁNGULO FIJO Ó ANGULARES ROTOR VERTICAL centrífuga baja velocidadUltracentrífuga

19 ROTORES FLOTANTES DESPUÉS PELLET SOBRENADANTE ANTES HOMOGENEIZADO CENTRIFUGACIÓN *En gradiente de densidad: *Centrifugación diferencial:

20 Fraccionamiento celular

21

22

23

24 CROMATOGRAFIA -por carga: intercambio iónico ej. DEAE (+), CM (-) -por tamaño: exclusión, los grandes primero ej. Sephadex = filtración por gel - por especificidad: afinidad entre proteína-proteína ej. anticuerpo

25 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

26 proteínas con carga positiva se unen al soporte que tiene carga negativa las proteínas con carga negativa pasan de largo Ej. intercambiador cationico

27 Cromatografía de Intercambio Ionico

28 CM-agarosa CARGA NEGATIVA carboximetil-agarosa

29 DEAE-columna CARGA POSITIVA Dietilaminoetil

30 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO Intercambio iónico - intercambiador cationico (tiene carga negativa, ej.carboximetil CM-) proteínas con más carga neta negativa pasan más rápido por la columna -intercambiador aniónico (tiene carga positiva, ej. DEAE+) proteínas con más carga neta positiva pasan más rápido por la columna

31

32 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

33 Cromatografía de filtración en gel

34

35

36

37 DIALISIS Separación por tamaño eliminación de sal

38 bolsa de diálisis solución concentrada tampón al principio de la diálisis en equilibrio

39 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

40 Cromatografía de Afinidad

41

42 Proteína retenido por interacción con ligando Elusión por adición de exceso de ligando

43 Perfil del aumento de la actividad especifica de una proteína durante la purificación

44 ELECTROFORESIS electro-foresis; del griego, estar llevado Def.: - Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico - Técnica que aplica este fenómeno Las proteínas se separan por - carga eléctrica - tamaño y forma

45 S S A1 A2 el -mercaptoetanol va a romper los enlaces –S–S– tanto inter- como intramoleculares mediante una reacción redox ( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro) -mercaptoetanol SH HS A1A2 + El DTT funciona del mismo modo que el -mercaptoetanol

46 Carga de los aminoácidos y proteínas con los cambios de pH a pH alcalino la mayoría de las proteínas va estar cargada negativamente

47

48

49 SH El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el desplegamiento de las mismas SDS – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser aproximadamente la misma (1.4gSDS/gproteina)

50 Fuente de poder electrodo de platinum reservorio de tampón superior e inferior única conexión eléctrica vía el gel Electrodo de platinum + CÁTODO ÁNODO

51

52

53 SDS-PAGE condiciones denaturantes fraccionamiento por tamaño comparación con estándar de tamaño molecular

54 Proteína purificada

55

56 Determinación de la secuencia de proteínas ESTRUCTURA PRIMARIA - composición de aa digestión con 5M HCl, análisis HPLC - determinación del aa amino terminal 2,4-dinitrophenyl, DNFB-amino-aa y aa libres - secuenciación de péptido (25-30aa) degradación Edman, del amino-aa sucesivamente

57

58 Pero: proteínas > 100 aa Proteínas - fragmentar - secuenciar péptidos - ordenar secuencia

59 Tratamiento Punto de ruptura tripsina quimotripsina proteasa V8 bromuro de cianogeno (CNBr) Lys, Arg Phe, Trp, Tyr Asp, Glu Met - C – C – N – C – C – N – C – C – N - O O O H H H R1R1 R2R2 R3R3 cortan el enlace peptídico

60 tratamiento Ej. péptidos secuenciados Tyr-Lys Glu-Met-Leu-Gly-Arg Pro-Met-Arg Met-Gly-Cys-Lys Leu-Gly-Arg-Met Tyr-Lys-Glu-Met Gly-Cys-Lys-Pro-Met + amino acido básico Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Cys-Lys-Pro-Met-Arg hidrólisis con tripsina hidrólisis con CNBr fragmentos con tripsina fragmentos con CNBr SECUENCIA deducida:

61

62


Descargar ppt "GK-07. Calor Microondas UV radiación Agitación fuerte Detergentes Metales pesados Solvente orgánicos Ácidos y bases fuertes Sales > Temperatura > pH >"

Presentaciones similares


Anuncios Google