Dra. Esther Z Vega Universidad de Puerto Rico Humacao

Presentación del tema: "Dra. Esther Z Vega Universidad de Puerto Rico Humacao"— Transcripción de la presentación:

1 Dra. Esther Z Vega Universidad de Puerto Rico Humacao
Purificación de DNA Dra. Esther Z Vega Universidad de Puerto Rico Humacao

2 Resumen DNA total DNA de plasmidio DNA de fagos

3 Aislamiento de DNA de bacteria
Las bacterias se cultivan en medio favorable a temperatura óptima Se lisan las células y se libera el contenido Tratamiento del extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA Se concentra la solución de DNA

4 DNA Purification > Total Cell

5 Crecimiento de la bacteria
Crecimiento de medio líquido Medio definido Medio complejo Crecimiento en medio sólido

6 Monitoreo del crecimiento
Growth can be monitored by optical density

7 Monitoreo del crecimiento
Growth can be monitored by optical density

8 Separación de células Colecta de células Centrifugación

9 Monitoreo del crecimiento
Preparación del extracto celular Las células deben lisarse para liberar el DNA Métodos Físicos Fuerza mecánica es aplicada para romper la pared y la membrana Mortero, sonicación Métodos Químicos Ataque químico a la pared y membrana celular Pared- lisozima, EDTA o ambos Membrana- detergente (SDS)

10 Lisis celular

11 Rompimiento de la pared
La lisozima digiere los polisacáridos, componentes estructurales de la pared EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlaza iones de magnesio esenciales en preservar la estructura de la célula e inhibe las enzimas que pueden degradar el DNA

12 Rompimiento de la membrana
SDS es un detergente que remueve las moléculas de lípidos

13 DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell

14 Centrifuge removes insoluble cell debris
DNA Purification > Total Cell Centrifuge removes insoluble cell debris

15 Purificación del DNA Además del DNA, todavía se encuentran una gran cantidad de proteínas y de RNA La remoción de éstas es importante para evitar interferencia en el análisis

16 Remoción de proteínas y RNA
Extracción orgánica Adición de fenol ó fenol/cloroformo Se precipitan las proteínas; formación de una capa blanca en la interfase entre la capa orgánica y la acuosa Se remueve la solución acuosa

17 DNA Purification > Total Cell > Purification
Organic Extraction

18 Extracción orgánica ¿Qué tal si hay un exceso de proteínas?
Se repiten las extracciones con fenol No favorable; destrucción del DNA con el movimiento Rompimiento con proteasa antes de la extracción Pronasa o proteinasa K

19 Extracción orgánica Parte del mRNA es removido con el tratamiento a fenol. El remanente del RNA puede ser digerido con ribonucleasas (si es necesario).

20 DNA Purification > Total Cell
Concentration of DNA

21 Extracción por Silica Guanidium thiocyanate
Desnaturaliza el material que no es DNA Hace que el DNA se enlace a las partículas de silica Se añade silica directamente o la muestra se pasa por una columna de silica Remoción de DNA al añadir agua

22 DNA Purification > Total Cell > Purification
Purificación de DNA con partículas de silica

23 Extracción de DNA de otros tipos de células
Células vegetales: alto contenido de carbohidratos Lisozima no tienen efecto Se añade CTAB (cetylmethylammonium); se une a los ácidos nucléicos y los precipita Se centrifuga y se remueve el sobrenadante Células animales: no tienen pared, lisan con SDS

24 Purification of Plant DNA
DNA Purification > Total Cell Purification of Plant DNA

25 DNA de plasmidio Se crece la bacteria y se colecta
Se rompen las células y se libera el contenido Se trata el extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA de plasmidio Se concentra la solución de DNA

26 DNA de plasmidio Separación basada en diferencias entre el plasmidio y el DNA bacterial tamaño- plasmidios son mucho más pequeños

27 Separación por tamaño En orden de maximar las diferencias, rompimiento mínimo del DNA bacterial Cuando el rompimiento es mínimo, el DNA formará parte del debris celular Rompimiento mínimo se logra utilizando técnicas de rompimiento suave

28 Rompimiento suave de la célula
Tratamiento con lisozima y EDTA en presencia de sucrosa evita el rompimiento inmediato Al formar esferoplastos, la célula puede lizarse con la adición de detergentes no-íonicos

29 DNA Purification > Plasmid DNA

30 Separación basado en conformación
Separación por el ¨superenrollamiento¨de pequeños plasmidios circulares

31 Separación basada en conformación
Rango de pH más estrecho cuando el DNA ¨superenrrollado¨es desnaturalizado y el DNA regular no. Se usa un lisado claro Al añadir base; DNA regular es desnaturalizado Al añadir ácido; DNA regular es una masa ¨enredada¨ El DNA ¨enredado¨es ¨pellet¨

32 DNA Purification > Plasmid DNA

33 Separación basado en conformación
DNA ¨superenrrollado¨ también puede ser separado del DNA regular utilizando bromuro de etidio en asociación con un gradiente de densidad con cloruro de cesio (CsCl)

34 Separación basado en conformación
Bromuro de etidio se enlaza a DNA normal, pero sólo en cantidad limitada a DNA ¨superenrrollado¨ Este enlazamiento causa un movimiento en la banda de DNA ¨normal¨

35 DNA Purification > Plasmid DNA

36 DNA Purification > Plasmid DNA

37 DNA de fagos El DNA de fagos puede estar fuera de la célula; no hay que comenzar con un extracto celular Al centrifugar el cultivo, la bacteria estará en el pellet y el fago en suspensión La dificultad es obtener una concentración grande de fagos por ml de cultivo

38 Para obtener títulos altos
El fago debe estar en fase lítica Los fagos deben infectar la baceria al m omento justo en el ciclo de crecimiento cI gene keeps phage in lysogenic phase cIts (temperature sensitive) mutants will enter ltic phase at 42 C

39 Purificación de DNA fagos
Los fagos pueden ser precipitados con glicol de polietileno (PEG) Centrifugar. Descartar el sobrenadante. Redisolver. Purificar por gradiente de densidad de CsCl.

40 www.dpo.uab.edu/~jglinvil/JS572web S572,FL06,MPurifyDNA.pdf