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Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés.

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Presentación del tema: "Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés."— Transcripción de la presentación:

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2 Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés

3 MASA El peso molecular es la masa de 1 mol de proteína, usualmente se expresa en daltones (Da). Un daltón es la masa atómica de un protón o neutrón.

4 TAMAÑO Å Å El tamaño de las proteínas es medido usualmente en masa molecular, aunque algunas veces se menciona su longitud y diámetro (en Å).

5 Carga pI es el pH al cual la carga neta de la proteína es cero. A bajos pH hay más cargas positivas en el ambiente entonces la proteína incrementa su carácter catiónico. De manera opuesta ocurre a pH por arriba del pI.

6 UNION A LIGANDOS Sustratos Hormonas Compuestos que simulan a un metabolito

7 Cromatografía Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Volumen de columna

8 Aprovecha la propiedad del tamaño Proteína Moléculas pequeñas

9 Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. En esta práctica se utilizará el gel dextrano. FASE ESTACIONARIA TipoPeso molecular Límite de fraccionamiento Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10Hasta G15Hasta G G G G G – G –

10 Cromatografía de intercambio iónico

11 Intercambio aniónico Fase estacionaria esta cargada positivamente Intercambio catiónico Fase estacionaria esta cargada negativamente

12 Los grupos de la resina cargados normalmente están neutralizados por iones del tampón. Estos iones son reversiblemente reemplazados por las proteínas con más tendencia a unirse al soporte. Las proteínas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catiónicos o aniónicos dependiendo de su carga neta. Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. La afinidad con la que una proteína se une a un intercambiador iónico depende de la fuerza iónica del medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la proteína y los iones de la fase móvil.

13 GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza iónica de la fase móvil (aumentando la concentración de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las proteínas mas débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas.

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15 Cromatografía de Afinidad

16 Sólo se retendrá la sustancia capaz de reaccionar con el ligando. Una vez concluida la separación hay que provocar la salida de la sustancia que dio la reacción específica.

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