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CROMATOGRAFÍA (parte II) Graciela Escandar. Cromatografía líquida líquida - líquida líquida - fase ligada intercambio iónico exclusión molecular líquida-sólida.

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Presentación del tema: "CROMATOGRAFÍA (parte II) Graciela Escandar. Cromatografía líquida líquida - líquida líquida - fase ligada intercambio iónico exclusión molecular líquida-sólida."— Transcripción de la presentación:

1 CROMATOGRAFÍA (parte II) Graciela Escandar

2 Cromatografía líquida líquida - líquida líquida - fase ligada intercambio iónico exclusión molecular líquida-sólida Líquida (cromatografía líquida) líquida sólida resina intercambio iónico gel poroso FM FE MÉTODO Sistemas a desarrollar

3 Cromatografía de reparto fase estacionaria LÍQUIDA Fundamento de separación: diferente solubilidad del analito en FM y FE Cromatografía líquida

4 cromatografía de partición o reparto CL convencional Fase ligada El líquido que constituye la FE está adsorbido sobre un soporte sólido inerte Las cadenas carbonadas que constituyen la FE están unidas por enlace covalente al soporte sólido inerte Cromatografía líquida

5 Cromatografía L-L convencional soporte inerte FE (líquida)

6 La mayoría de las fases ligadas se forman a partir de partículas de sílicagel, a las que se les une covalentemente cadenas carbonadas que actúan como FE Si O O HO OH O Si O O OH Representación esquemática de partícula de silicagel Fase unida o ligada grupo silanol

7 grupo silanol reactivo unión siloxano - HCl + Si H OH O O C 3 CH 3 R unión siloxano alquil clorosilano SiOH OH O CH 3 R Cl C H 3 Fase ligada: empaque de siloxanos Cromatografía líquida

8 -2 HCl + 2 ClSiR 2 alquil diclorosilano SiOH OH O O O R 2 O Fase ligada: empaque de siloxanos Cromatografía líquida

9 Ejemplos de fases ligadas Fase reversa Hexil, C6 Octil, C8 Octadecil, C18 fenil

10 H H N NO Ejemplo de interacción con fase normal enlace de hidrógeno entre el analito y la ciano-superficie

11 Índice de polaridad: describe cuantitativamente la polaridad del solvente en el reparto Fluoroalcanos < -2 Ciclohexano 0.04 Tolueno2.4 Cloroformo4.1 Etanol4.3 Acetato de etilo4.4 Metanol5.1 Nitrometano6.0 Etilenglicol6.9 Agua10.2 SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P)

12 Cromatografía de adsorción Fase estacionaria sólida Fundamento de separación: el analito interacciona con sitios activos de la superficie de la FE. Intervienen fuerzas de van der Walls, enlaces de hidrógeno, etc. Adsorbentes: silicagel*, alúmina*, C*, CaCO 3, MgCO 3

13 ¿¿¿ Ab- o ad-sorción ??? absorción adsorción

14 Cromatografía de adsorción solvente flujo FE soluto adsorbido soluto desorbido

15 Alúmina O O O O O O Al O O O O O O O H Si O H O O H solvente débil analito Si O H O O H H O R O R solvente fuerte analito solvente Cromatografía de adsorción Sílicagel

16 Fuerza del solvente (energía de adsorción del solvente por unidad de área del adsorbente). Se mide con el parámetro de Snyder ( °). Fluoroalcanos Ciclohexano Tolueno Cloroformo Acetato de etilo Etanol Metanol Etilenglicol Agua grande grande SOLVENTE O (SiO 2 ) O (Al 2 O 3 )

17 Cromatografía de intercambio iónico Fase estacionaria resinas de intercambio iónico Fundamento de separación: se produce intercambio reversible de iones entre el analito y la FE. Intervienen fuerzas electrostáticas.

18 Resinas de intercambio catiónico: ácido fuerte Cromatografía de intercambio iónico

19 Resinas de intercambio catiónico: ácido debil Cromatografía de intercambio iónico

20 Resinas de intercambio aniónico: base fuerte Cromatografía de intercambio iónico

21 Resinas de intercambio aniónico: base debil Cromatografía de intercambio iónico

22 x RSO 3 H + + M x+ (RSO 3 ) x M x+ + x H + sólido solución El intercambio de cationes se ilustra con el equilibrio El intercambio de aniones se ilustra con el equilibrio x RN(CH 3 ) 3 + OH - + A x- [RN(CH 3 ) 3 + ] x A x- + x OH - sólido solución Cromatografía de intercambio iónico

23 Diferentes empaques en Intercambio Iónico vidrio película intercambiadora: microesferas de sílica (1 - 2 m) cubiertas con intercambiador iónico 30 – 40 m Resina pelicular Resina macroreticular macroporos

24 grupos cargados negativamente mezcla de aminoácidos Ejemplo de una separación por intercambio iónico resina intercambiadora catiónica Los AA se mueven a través de la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH usado. Los AA con carga neta negativa grande eluyen 1 ro carga neta positiva grande carga neta positiva carga neta negativa carga neta negativa grande

25 Cromatografía de exclusión molecular FE: geles porosos Hidrofílicos Hidrofóbicos Filtración en gel Permeación en gel Fundamento de separación: separación en base a forma y tamaño del analito Fase estacionaria: geles hidrofílicos (Sephadex), geles de poliacrilamida (biogeles), geles rígidos de sílica o vidrio con determinados tamaños de poro.

26 Exclusión molecular

27 K = 0.2 K = 0.5 Rta Volumen VSVS VMVM Exclusión total Permeación selectiva Permeación total Volumen PM V R - V M V S K = K = 0 K = 1 Exclusión molecular

28 ligando unido covalentemente empaque muestra analito etapa de lavado etapa de elución columna regenerada solución con analito puro + etapa de interacción Cromatografía de afinidad

29 PM no polariónico polar no iónico Aumento de la polaridad adsorción intercambio iónico partición fase reversa fase normal exclusión permeación en gel filtración en gel Elección del sistema cromatográfico

30 Elección de la fase móvil fase móvil interactiva y fase móvil no-interactiva reparto, adsorción, intercambio iónico CG y exclusión molecular los tiempos de retención están fuertemente influenciados por el tipo de FM utilizada participación activa en la separación los tiempos de retención son independientes de la FM utilizada la FM solo transporta la muestra a través de la FE


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