Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés.

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2 Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés

3 CaracterísticasProcedimiento Solubilidad1.Salting in 2.Salting out Carga iónica1.Cromatografia de intercambio iónico 2.Electroforesis Polaridad1.Cromatografía de adsorción 2.Cromatografía en papel 3.Cromatografía fase inversa 4.Cromatografía interacción hidrófoba Tamaño molecular1.Dialisis y ultrafiltración 2.Electroforesis en gel 3.Cromatografía en filtración en gel 4.Ultracentrifugación Especificidad de unión1. Cromatografía de afinidad

4 MASA TAMAÑO Å Å kDa

5 Carga

6 Reconocimiento molecular

7 Cromatografía Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes. Volumen de columna Muestra aplicada Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

8 Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna. Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columnaLongitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

9 PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor masa molecular

10 APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación del peso molecular de las proteínas TIPOS DE MATRIZ GRANULOS DE UN MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO Dextranos con enlaces cruzados Agarosa Poliacridamida

11 En esta práctica se utilizará el gel dextrano. FASE ESTACIONARIA TipoPeso molecular Límite de fraccionamiento Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10Hasta 7001.02 G15Hasta 15001.53 G251000 - 50002.55 G501500 - 30 0005.010 G753000-80 0007.512-15 G1004000 - 15000010.015-20 G1505000 – 400 00015.020-30 G2005000 – 800 00020.030-40

12 Cromatografía de intercambio iónico

13 Intercambio aniónico Fase estacionaria cargada positivamente Intercambio catiónico Fase estacionaria cargada negativamente

14 GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

15 Factores que afectan a la retención 1. Fuerza Iónica 2. pH 3. Modificadores Orgánicos

16 Cromatografía de Afinidad

17 Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.

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19 VENTAJAS: No hay restricción por volumen. Especificidad Pureza del producto final DESVENTAJAS: Precio (alto) Condiciones de elución drásticas Ligando específico no disponible o inadecuado

20 Determinación de la concentración de proteína Métodos espectrofotométricos Ventajas de la técnica Rápida Precisa Versátil Fácil de usar Eficiente en costo

21 Son métodos cuantitativos de análisis químico que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas. Espectrofotométria de absorción visible (Colorimetría) Absorción ultravioleta (UV) Infrarroja ESPECTROFOTOMETRÍA

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23 RadiaciónEfectoTécnica Espectroscópica Información Obtenida UV- VISTransiciones electrónicas entre los orbitales atómicos y moleculares Espectroscopía ultravioleta-visible Existencia de cromóforos y/o conjugación en la molécula a las absorciones observadas

24 Tungsteno (visible) Deuterio (UV)

25 LEY DE LAMBERT Y BEER Establece que la absorbancia es proporcional al número de moléculas absorbentes por las que pasa la luz. A = ε*C*b A = absorbancia C= concentración b=longitud de la celda ε= coeficiente de extinción o absortividad molar?

26 Es una propiedad intrínseca de los compuestos. Es una medida de absorción de luz de las especies químicas a una determinada longitud de onda Unidades ε=M -1 cm -1 Coeficiente de extinción o absortividad molar

27 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA Los métodos más usuales son: -Absorción en el ultravioleta. -Reacción del Biuret. -Método de Lowry. -Método de Bradford.

28 Es un método no destructivo. El intervalo de concentración que se puede determinar depende del contenido de los aminoácidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml. La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias. Absorción en el ultravioleta

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31 Las características más importantes de la reacción son: La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas. Su intervalo de determinación es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composición de aminoácidos. Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción. Complejo proteína-Cu(II) (Proteína en solución alcalina) Método de Biuret Coloración violeta-púrpura (540nm)

32 Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu 2+. Método de LOWRY REACCIÓN DE BIURET + REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU (750 nm)

33 El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar). La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos. Método de BRADFORD

34 MÉTODOVENTAJASDESVENTAJAS Método de AbsorciónNo se pierden las muestrasInterfieren compuestos que absorben en el UV MÉTODOS COLORIMÉTRICOS BiuretEspecífico para proteínas, muestra pocas interferencias es barato Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL LowryTiene bastante sensibilidad de 0,1-1 mg/mL. No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio BradfordMuy sensible 0,5 -1,4 mg/mL Muestra interferencias con detergentes

35 Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de proteínas presente en una muestra incógnita. Curva Patrón BSA (µg) A 595nm A 280nm

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