Purificación de proteínas Parte II

Presentación del tema: "Purificación de proteínas Parte II"— Transcripción de la presentación:

1 Purificación de proteínas Parte II

2 Purificación de proteínas
Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés

3 Métodos de Baja resolución Métodos de Alta Resolución
Empezar a separar Métodos de Baja resolución Precipitación con sales, precipitación con temperatura y pH Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante Métodos de Alta Resolución

4 Características Procedimiento Solubilidad Salting in Salting out Carga iónica Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Polaridad Cromatografía de adsorción Cromatografía en papel Cromatografía fase inversa Cromatografía interacción hidrófoba Tamaño molecular Dialisis y ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografía en filtración en gel Ultracentrifugación Especificidad de unión 1. Cromatografía de afinidad

5 Propiedades Sal más usada: Sulfato de Amonio

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7 Å kDa MASA TAMAÑO

8 Carga pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.
pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble

9 Las proteínas son moléculas cargadas
De Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea

10 Reconocimiento molecular

11 Cromatografía Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes. Volumen de columna Muestra aplicada Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

12 Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna. Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columnaLongitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

13 Cromatografía de exclusión molecular
PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor masa molecular

14 GRANULOS DE UN MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO
APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación del peso molecular de las proteínas TIPOS DE MATRIZ GRANULOS DE UN MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO Dextranos con enlaces cruzados Agarosa Poliacridamida

15 Límite de fraccionamiento Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco)
FASE ESTACIONARIA En esta práctica se utilizará el gel dextrano. Tipo Peso molecular Límite de fraccionamiento Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10 Hasta 700 1.0 2 G15 Hasta 1500 1.5 3 G25 2.5 5 G50 5.0 10 G75 7.5 12-15 G100 10.0 15-20 G150 5000 – 15.0 20-30 G200 5000 – 20.0 30-40

16 Cromatografía de intercambio iónico

17 Intercambio catiónico
Fase estacionaria cargada negativamente Intercambio aniónico Fase estacionaria cargada positivamente

18 GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

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20 Factores que afectan a la retención
Fuerza Iónica 2. pH 3. Modificadores Orgánicos

21 Cromatografía de Afinidad

22 Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.

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24 VENTAJAS: No hay restricción por volumen. Especificidad Pureza del producto final DESVENTAJAS: Precio (alto) Condiciones de elución drásticas Ligando específico no disponible o inadecuado

25 Determinación de la concentración de proteína
Métodos espectrofotométricos Ventajas de la técnica Rápida Precisa Versátil Fácil de usar Eficiente en costo

26 MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS Método de Absorción No se pierden las muestras Interfieren compuestos que absorben en el UV MÉTODOS COLORIMÉTRICOS Biuret Específico para proteínas, muestra pocas interferencias es barato Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL Lowry Tiene bastante sensibilidad de 0,1-1 mg/mL. No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio Bradford Muy sensible 0,5 -1,4 mg/mL Muestra interferencias con detergentes

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28 Ir constryendo su tabla de purificación...