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Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés.

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Presentación del tema: "Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés."— Transcripción de la presentación:

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2 Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés

3 Métodos de Baja resolución Precipitación con sales, solventes, temperatura o pH Métodos de Alta Resolución Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante

4 CaracterísticasProcedimiento Solubilidad1.Salting in 2.Salting out Carga iónica1.Cromatografia de intercambio iónico 2.Electroforesis Polaridad1.Cromatografía de adsorción 2.Cromatografía en papel 3.Cromatografía en fase reversa 4.Cromatografía interacción hidrófoba Tamaño molecular1.Dialisis y ultrafiltración 2.Electroforesis en gel 3.Cromatografía de filtración en gel 4.Ultracentrifugación Especificidad de unión1. Cromatografía de afinidad

5 Sal más usada: Sulfato de Amonio

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7 Solubilidad de las proteínas en Sulfato de Amonio Fibrinogeno Mioglobina

8 Lactato deshidrogenasa

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12 Homogenización 1)100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo) 2)Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.) 3)Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0) 4)Centrifugar a 7,000 rpm 4° C 10 min. 5)Decantar sndnte y tomar fracción 1 mL (F1) 6)Guardar fracciones a -20°C Precipitación por salado 1)25 mL del sndnte en vaso de pp. 2)Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio (55 % de saturación) 3)Centrifugar a 4°C a 10,000 rpm 10 min. 4)Registrar volumen y tomar 1 mL fracción 2 (F2) Guardar a -20°C 5)Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y 3 6)Descartar el sndante 7)Resuspender botón o pellet en 1 mL de agua 8)Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20°C

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14 Carga pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación. pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble

15 Cromatografía Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes. Volumen de columna Muestra aplicada Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

16 Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna. Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

17 MASA TAMAÑO Å Å kDa

18 PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor masa molecular

19 APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación del peso molecular de las proteínas TIPOS DE MATRIZ GRANULOS DE UN MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO Dextranos con enlaces cruzados Agarosa Poliacrilamida

20 En esta práctica se utilizará el gel dextrano. FASE ESTACIONARIA TipoPeso molecular Límite de fraccionamiento (daltons) Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10Hasta G15Hasta G G G G G – G –

21 Las proteínas son moléculas cargadas De Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea

22 Cromatografía de intercambio iónico

23 Intercambio aniónico Fase estacionaria cargada positivamente Intercambio catiónico Fase estacionaria cargada negativamente

24 GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

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26 Factores que afectan a la retención 1. Fuerza Iónica 2. pH 3. Modificadores Orgánicos

27 Reconocimiento molecular

28 Cromatografía de Afinidad

29 Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.

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33 kDa Pellet W. Succinogenes 30 kDa M. Genitalium 28 kDa Flow Wash Pur. Prot. Pellet Flow Wash Pur. Prot. IOJAP

34 VENTAJAS: No hay restricción por volumen. Especificidad Pureza del producto final DESVENTAJAS: Precio (alto) Condiciones de elución drásticas Ligando específico no disponible o inadecuado

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36 Determinación de la concentración de proteína Métodos espectrofotométricos Ventajas de la técnica Rápida Precisa Versátil Fácil de usar Eficiente en costo

37 MÉTODOVENTAJASDESVENTAJAS Método de AbsorciónNo se pierden las muestrasInterfieren compuestos que absorben en el UV MÉTODOS COLORIMÉTRICOS BiuretEspecífico para proteínas, muestra pocas interferencias es barato Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL LowryTiene bastante sensibilidad de 0,1-1 mg/mL. No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio BradfordMuy sensible 0,5 -1,4 mg/mL Muestra interferencias con detergentes

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