Técnicas moleculares I

Presentación del tema: "Técnicas moleculares I"— Transcripción de la presentación:

1 Técnicas moleculares I
“Tecnología del ADN”

2 Estructura y características de los ácidos nucleicos
mRNA

3 Propiedades físico-químicas de los AN

4 Temperatura de melting

5 Procariotas vs Eucariotas
Genoma de un mamífera 3 Gb Genoma de E.coli 1,2 Mb

6 Tecnología del ADN recombinante
Clivaje del ADN en sitios específicos mediante endonucleasas de restricción, que facilitan el aislamiento y manipulación de genes. Hibridización de AN que hace posible detectar secuencias específicas de ADN y ARN. Clonado de ADN usando tanto vectores de clonado como la técnica de PCR Secuenciación de los nucleótidos que componen un determinado fragmento de ADN Monitoreo de la expresión de genes en una célula mediante microarrays

7 Enzimas como herramientas de la tecnología del ADN

8 secuencias palindrómicas
Clivaje de secuencias específicas del ADN: Enzimas de restricción Extremos romos En general reconocen secuencias palindrómicas Extremos cohesivos 5’ extendido 3’ extendido

9 Técnicas electroforéticas: separación, purificación e identificación de AN
Permiten separar las moléculas de AN por tamaño. Geles de: Agarosa Poliacrilamida

10 Clivaje y purificación de secuencias específicas de ADN
MAPA DE RESTRICCION PURIFICACIÓN DEL ADN

11 Marcaje de fragmentos de ADN: ADN polimerasa y Polinucleótido quinasa
Oligonucleótidos: son fragmentos cortos de AN de simple cadena, cuya secuencia es conocida y se encuentra marcado para su posterior seguimiento

12 Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Southern blot

13 Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Northern blot

14 Ejemplos de Southern blot y Northern blot
Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda Calle 1-9: muestras a chequear Calle L: ladder, patrón de tamaño Calle 10: control positivo Calle M: ladder, patrón de tamaño

15 Detección de secuencias de AN específicas: Hibridización in situ

16 Clonado de ADN: Enzima ADN ligasa y vectores de clonado
Componentes mínimos: 1- Origen de replicación 2- Gen marcador de selección 3- Sitios de restricción “polylinker”

17 Vectores de clonado: Plásmidos
Estructura CCC y su tamaño es de 3-10 kb y aceptan insertos de hasta 10 kb

18 Otros tipos de vectores
Fagos: 50 kb y aceptan 15 kb Cósmidos: híbrido plásmido y fago L (30-40 kb) Fásmidos: híbrido plásmido y fago M3 Cromosomas artificiales: BACs, PACs y YACs ( kb)

19 Transferencia de la químera de ADN a la célula huesped

20 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Ciclos: Desnaturalización (92-95 ºC) Hibridación (35-60 ºC) Polimerización (72 ºC)

21 PCR : incorporación de secuencias de restricción

22 Digerir con ER3 plásmido y
EJEMPLO: Objetivo comparar genomas y aislar gen X del jerbo. Aislar ADN genómico de ambos animales e identificar y comparar gen X en ambas especies Calle L: Ladder patrón de tamaño Calle 5, 7 y 9: controles negativo Calle 6: ADN del jerbo digerido con ER1 Calle 8: ADN del ratón digerido con ER1 Calle 10: gen X de ratón Southern blot ER1 ER2 ER2 ER1 ER2 ER3 L ER3 ER3 purificación del gen Gen x jerbo + gen X + ADN ligasa ER3 PCR Ligación Digerir con ER3 plásmido y fragmento de PCR Gen x jerbo ER3 Transformar bacterias Extracción de ADN plasmídico: TECNICA DE MINIPREP Chequeo de colonias

23 Extracción de ADN plasmídico a partir de bacterias
Introducción a los TP 1 y 2 Extracción de ADN plasmídico a partir de bacterias Miniprep- Hidrólisis alcalina Cuantificación y análisis de pureza Chequeo del extracto mediante electroforesis en gel de agarosa

24 TP nº 1: Extracción y cuantificación de DNA plasmidico

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