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ENZIMOPATIAS ERITROCITARIAS Química Biológica Patológica Dra. Silvia Varas I-Deficiencia G6PD II- Def. Piruvato Quinasa Tema:3.

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ENZIMOPATIAS ERITROCITARIAS Química Biológica Patológica Dra. Silvia Varas I-Deficiencia G6PD II- Def. Piruvato Quinasa Tema:3 (Bolilla3)

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1 ENZIMOPATIAS ERITROCITARIAS Química Biológica Patológica Dra. Silvia Varas I-Deficiencia G6PD II- Def. Piruvato Quinasa Tema:3 (Bolilla3)

2 Programa QBP TEMA 3: Alteraciones en el metabolismo de hemoglobina: Hemoglobinas estructurales y Talasemias, Consecuencias clínicas y metabólicas, diagnóstico bioquímico y molecular. Mecanismo molecular del defecto genético. Enzimopatías eritrocitarias: deficiencia de piruvatoquinasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.

3 Deficiencia de Glucosa 6 P-deshidrogenasa Historia

4 Pitágoras ( a. C.) Habas (Vicia faba) 1- Teoría Tóxica

5 Historia 2º- teoría alérgica asociado al consumo de las habas, en un principio no se había asociado a una enfermedad heredable. 3º-Una tercera etapa fue el reconocimiento de una anemia hemolítica causado por drogas.

6 Historia La primaquina es una droga usada para el tratamiento de la malaria. Se acuño el termino de primaquina sensible a los eritrocitos de los individuos con esta deficiencia

7 El estadio final del descubrimiento por Carson y col. (1956) quien demostraron que el defecto metabólico primario en sujetos susceptibles a la primaquina esta asociada a una baja actividad de la G6PD en los eritrocitos. Hacia 1958, Gross et al., por un lado y Szeinberg et al. por otro, determinaron que la deficiencia enzimática tenía una base hereditaria y sugirieron que estaba ligada al sexo.

8 Gen G-6PD Disqueratosis CongénitaCeguera al Color Hemofilia A

9 G6PD En los eritrocitos se encuentra en sus formas dimérica y tetramérica y las dos formas estan en un equilibrio dependiente de pH, con iguales proporciones a pH neutro Figura Nº2: Un dímero de glucosa-6-fosfato deshidrogenada humano. Subunidades A y B son de color rojo y azul. Las moléculas estructurales de NADP+ se dibujan en un modelo y es de color azul oscuro. La actividad catalítica sólo se inicia cuando se establece una asociación en estado de equilibrio entre las formas dimérica y tetramérica. Tal asociación requiere de la presencia de NADP +. La disminución del pH provoca un cambio hacia la forma tetramérica

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11 Ruta de las Pentosas Fosfato de Oxidación

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13 Reacciones en los eritrocitos en las que se produce y es destoxificado de H 2 O 2 GSSG: glutathione disulfide (oxidized glutathione)

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15 R I OxiHb (6HS) Hemicromo 1 (Reversible) Hemicromo 2 (Irreversible) Precipita (4 HS) LISIS Hb sin hem Cadenas precipitadas NADH NAD+ H2O2 H2O Superóxido dismutasa Glutation peroxidasa GSH GSSG Formación Cuerpos Heinz Cuerpos de Heinz (unido MP) MetaHb (6HS) + O2 Catalasa -

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17 Mecanismo Molecular de Lisis La posible secuencia de eventos seria: Los hemicromos se unen a banda 3, catalizan la oxidación de Banda 3. Entrecruzamiento oxidativo de Banda 3. Inmediata asociación con Syk (Spleen tyrosine kinase), fosforilación de treoninas de Banda 3. La fosforilación marca la disminución de afinidad con la anquirina y liberación del citoesqueleto (espectrina/actina). Aumenta la movilidad lateral en la bicapa (clustering) de Banda 3. Formación de agregados de Banda 3. Progresiva vesiculación. Perdida de la membrana plasmática y LISIS celular

18 Tomado de: Pantaleo A, Ferru E, Carta F, Mannu F, Simula LF, et al. (2011) Irreversible AE1 Tyrosine Phosphorylation Leads to Membrane Vesiculation in G6PD Deficient Red Cells. PLoS ONE 6(1): e15847

19 Deficiencia de G6PD G6PD deficiencia es un defecto genético hereditario ligado-X. El defecto es causado por mutaciones en el gen G6PD, que resulta en variantes de proteína con diferentes niveles de actividad enzimática, Esto esta asociado a una amplia rango de fenotipos clínicos y bioquímicos. La prevalencia global es estimada en 4,9%, con alrededor de 330 millones de personas afectados en todo el mundo.

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21 Deficiencia de G6PD: Variantes De acuerdo con su nivel de actividad, las variantes de la enzima, se agruparon en cinco clases, que son: Clase 1: Deficiencia severa de la enzima con anemia hemolítica crónica no esferocítica (CNSHA). Clase 2: Deficiencia enzimática severa (1- 10% actividad residual) asociado con anemia hemolítica aguda. Clase 3: Deficiencia enzimática moderada (10%- 60%, actividad residual). Clase 4: Actividad Normal (60%-150%). Clase 5: Actividad enzimática por encima de lo normal (150%).

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23 Manifestaciones Clínicas: 1-Anemia Hemolitica inducida por drogas 2-Anemia Hemolitica inducida por infección 3-Favismo 4- Bilirrubina Neonatal

24 1-Anemia Hemolítica inducida por drogas Son asintomático hasta la administración de un fármaco.

25 1-Anemia Hemolítica inducida por drogas El paciente desarrolla fiebre, orina de color negro(Hemoglobinuria), ictericia y anemia La necrosis tubular aguda puede complicar el episodio hemolítico severo Cuando ingieren drogas o químicos que desencadenan la hemólisis masiva intravascular En algunos pacientes, la coagulación intravascular diseminada (CID), puede ser una complicación

26 1-Anemia Hemolítica inducida por infección el estrés oxidativo, por lo que disminuye la capacidad protectora de la célula. La necrosis tubular aguda puede complicar el episodio hemolítico severo Una teoría es que la generación de H 2 O 2 por los PMN neutrófilos puede provocar una disminución en la cantidad de glutatión reducido En algunos pacientes, la coagulación intravascular diseminada (CID), puede ser una complicación Virus Hepatitis A y B, citomegalovirus, pneumonia, y fiebre tifoidea son causas comunes

27 1 y 2-Anemia Hemolítica: CONSECUENCIAS Fatiga Dolor de Espalda Anemia Ictericia Bilirrubina No Conjugada y Lactato Deshidrogenasa, Y Reticulocitosis son los marcadores del desorden.

28 3-Favismo Consumo de habas frescas Las sustancias tóxicas asociadas son Divicina, isouramil, y convicina. Manifiesta 24 hs luego de la ingesta Hemoglobinuria es mas severa que la causada por las crisis hemolíticas producidas por drogas o infección (con Bilirrubina baja). Anemia es generalmente aguda y severa, genera falla renal aguda debido a isquemia o a la precipitación de hemoglobina

29 4- Bilirrubina Neonatal Cerca de 1/3 de los neonatos varones nacidos con ictericia neonatal tienen deficiencia de G6PD La ictericia neonatal puede ser subclínica o llevar al kernicterus, que consiste en daño cerebral y de los nervios auditivos por niveles elevados de bilirrubinemia neonatal no conjugada, y puede llevar a discapacidad intelectual, parálisis cerebral, sordera y muerte.

30 Bilirrubina Neonatal B Libre = Bilirrubina Libre/ Bilirrubina Total. 100 = 80%

31 4- Bilirrubina Neonatal Hacer estudios para Def. G6PD: A los neonatos (1- 4d) que desarrollan hiperbilirrubinemia (bilirrubina No Conjugada o Libre (indirecta) concentraciones mayores que 8,8mg/dl [150M/L]) Bilirrubina Indirecta >95%de la Total dentro de las primera 24 h de vida, o en aquellos con antecedentes familiares de hermanos con ictericia

32 CARACTERÍSTICAS DE LABORATORIO Anemia y reticulocitosis Cuerpos de Heinz La presencia de células crenadas o equinocitos

33 Control Normal El Test de cuerpos de Heinz para la sensibilidad de la primaquina (Deficiencia de G6PD). Las células (derecha) son de un donante sensible (G6PD-deficiencia), las células en el panel de la izquierda, de un control normal. Deficiencia de G6PD

34 Una tinción histoquímica indirecta de los eritrocitos de un paciente heterocigoto para la deficiencia de G6PD que sufría de malaria adquirida de forma natural. Las células más pigmentadas son aquellos que contienen actividad normales G6PD. Ellos contienen el mayor porcentaje de parásitos de la malaria, como se muestra por las flechas

35 Diagnóstico Bioquímico: Actividad Enzimática Medir la actividad enzimática de G6PD en eritrocitos, por métodos cuantitativos con análisis espectro- fotométrico de la tasa de producción de NADPH a partir de NADP + a 340nm.

36 Diagnóstico Molecular: Más del 95% de las mutaciones son mutaciones puntuales que generan mutaciones sin sentido o con cambio de sentido. Las mutaciones generan (+) o desaparecen (-) un sitio de corte para una enzima de restricción. Las mutaciones más comunes (Mediterráneo, A-, Seattle, Unión) pueden ser rápidamente detectadas por amplificación del fragmento de interés seguido de digestión con la enzima de restricción (MboII, NlaIII, DdeI o HhaI, respectivamente).

37 Deficiencia de Piruvato quinasa

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40 Deficiencia de PQ PK deficiencia (OMIM ) es la causa hereditaria más común de anemia hemolítica no esferocítica (HNSHA) La enfermedad se hereda de forma autosómica recesiva Muestra una distribución en todo el mundo. La prevalencia estimada es de 51 casos por millón (es decir, 1:20.000) en la población blanca.

41 Piruvato Quinasa Deficiencia La mutación 1529G A es la mas común en USA y en centro y norte de Europa; La mutación 1456C T es la que prevalece en el sudeste de Europa (España,Italia, Grecia); Y la mutación 1468C T es la mas común en Asia.

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43 Características Clínicas Anemia hemolítica crónica variando en severidad desde asintomática y totalmente compensada a casos con requerimientos de trasfusiones a lo largo de la vida. Grados variables de ictericia suave a moderada esplenomegalia Elevadas concentraciones de 2,3-DPG Otros efectos clínicos incluyen retraso del crecimiento, kernicterus, hidropesía fetal, ulceras crónicas en las piernas, pancreatitis aguda secundaria a enfermedad del tracto biliar, sobrecarga de hierro, absceso esplénico, compresión del cordón espinal por tejido hematopoyético extramedular y flebitis migratoria con trombosis arterial esta son raras complicaciones.

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45 Los bajos niveles de hemoglobina pueden ser tolerados debido a una disminución de la afinidad del oxigeno inducido por elevadas concentraciones de 2,3-DPG, característica de deficiencia de PK

46 Hallazgos Hematológicos Equinocitos En pacientes con esplenectomía se pueden observar siderocitos, células target, y cuerpos de Howell-Jolly La formación de cuerpos de Heinz incubados puede estar incrementada. Al ser una anemia hemolítica, se observa una disminución en la concentración de haptoglobina e hiperbilirrubinemia indirecta e incremento en la excreción de urobilinógeno fecal. Tinción de células con Azul dePrusia

47 Equinocitos (célula crenada)

48 Diagnóstico Disminución de la actividad de PK en los eritrocitos. Los pacientes homocigotas para PK deficiencia la actividad es de un 5- 25% de la observada en un eritrocito normal y de un % en portadores heterocigotos.

49 Bioquímica y Biología Molecular: Isoenzimas Naturales Las isoenzimas relacionadas a un tejido son generalmente homotetrámeros de subunidades de 50 a 60 kDa, productos de genes localizados sobre el cromosoma 1 y 15.

50 PK-M2: determinado en el locus 15q22, puede ser considerado la isoenzima natural prototipo, es la forma presente en varios tejidos durante la vida fetal temprana. Pero PK-M2 persiste como la forma principal en leucocitos, plaquetas, pulmón, riñón, bazo, tejido adiposo y como un componente menor en hígado. PK-M1: es un producto del mismo locus genético obtenido por splicing alternativo y es la forma predominante en músculo estriado maduro y cerebro. Es la única isoenzima que no esta sometida a modulación por sustrato o cofactor. PK-L: es la isoenzima natural predominante en hepatocitos esta codificada por un gen en el cromosoma 1q21. Es un homotetrámero de subunidades L, cada uno constituido por 543 aminoácidos. PK-R: es la tercera isoenzima natural, es única en los eritrocitos maduros. Esta bajo control del mismo locus de PK-L, pero es un producto de transcripción distinto con un extremo 5 distinto, producto de un promotor especifico de tejido

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52 (-)

53 RESUMEN:

54 Terapia: El tratamiento será sintomático: Transfusiones de eritrocitos cuando los niveles de Hemoglobina han descendido demasiado. Esplecnotomía en niños con severa anemia, con ello incrementa 1-3 g/dl los niveles de hemoglobina reduciendo los requerimientos de trasfusiones

55 Alguna pregunta?

56 Bibliografía general: LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L. Principios de Bioquímica. Editorial OMEGA 4º Edición Diapositivas en Power Point (formato ppt) (Manual para docentes) LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L. Principios de Bioquímica Web: The Journal of Biological Chemistry: Classic Articles Web: VOET DONALD, VOET JUDITH G. Bioquímica Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 3º Edición, en Español WATSON, BAKER, BELL, GANN, LEVINE, LOSICK Biología Molecular del Gen Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 5º Edición, en Español STRYER LUBERT, BERG JEREMY M., TYMOCZKO JOHN L. Bioquímica Editorial REVERTE. Edición 5º Edición, en Español MATHEWS CHRISTOPHER K., AHERN KEVIN G., VAN HOLDE K. E. Bioquímica Editorial PEARSON EDUCACION. 3º Edición en Español Diapositivas (formato ppt), Problemas (Manual para docentes) y Casos Clínicos de Aplicación VOET DONALD, VOET JUDITH G. and PRATT CHARLOTTE W. Fundamentals of Biochemistry Second Edition. Copyright © 2006 by John Wiley & Sons, Inc Web: www. medicapanamericana.com/voet/medicapanamericana.com/voet/

57 Bibliografía especifica: - CHARLES R. SCRIVER, ARTHUR L. BEAUDET, WILLIAM S. SLY AND DAVID VALLE: THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE. Volume I,II and III. Seventh Edition.Mc Graw-Hill Editors - LUCIO LUZZATTO & ATUL MEHTA. Chapter 111: Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases. Volume III. Charles R. Scriver, Arthur L. Beaudet, William S. Sly and David Valle, EDITORS. McGraw-Hill, New York. Seventh Edition. (p ). - KOIUCHI R. TANAKA & DONALD E. PAGLIA. Chapter 114: Pyruvate kinase and other enzymopathies of the erythrocyte. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases. Volume III. Charles R. Scriver, Arthur L. Beaudet, William S. Sly and David Valle, EDITORS. McGraw-Hill, New York. Seventh Edition. (p ). - ERNEST BEUTLER: Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 2008; 111: ERNEST BEUTLER: Deficiency G6PD. Blood Vol 84, No 11, 1994 pp LUCIO LUZZATTO, ATUL MEHTA, TOM VULLIAMY. PART 19: BLOOD: Chapter 179: Glucose 6- Phosphate Dehydrogenase Deficiency. En Scriver CR, Beaudet AL, Sly W S, Valle D (eds). The online metabolic & molecular bases of inherited disease. New York, McGraw Hill, 2012; pag AKIRA HIRONO, HITOSHI KANNO, SHIRO MIWA, ERNEST BEUTLER: PART 19: BLOOD: Chapter 182: Pyruvate Kinase Deficiency and Other Enzymopathies of the Erythrocyte. En Scriver CR, Beaudet AL, Sly W S, Valle D (eds). The online metabolic & molecular bases of inherited disease. New York, McGraw Hill, 2012; pag ALBERTO ZANELLA, ELISA FERMO, PAOLA BIANCHI, AND GIOVANNA VALENTINI. Red cell pyruvate kinase deficiency: molecular and clinical aspects. British Journal of Haematology, 2005, 130, 11–25 - AMANDO GARRIDO PERTIERRA (Tesis Doctoral) Genética molecular de la deficiencia eritrocitaria humana en piruvato quinasa. Universidad Complutense de Madrid. España. BLOG:


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