Espectrofotometría de Absorción Molecular UV/VIS

Presentación del tema: "Espectrofotometría de Absorción Molecular UV/VIS"— Transcripción de la presentación:

1 Espectrofotometría de Absorción Molecular UV/VIS
50 MPR/100 /300 Varian Ibérica

2 NUEVA GAMA CARY Cubre el rango completo de aplicaciones espectrofotométricas: Cary 50 Rutina y cinéticas rápidas Cary 100 Doble haz de prestaciones medias Cary 300 Altas prestaciones, cinéticas.

3 CARY 50 Calidad Cary a buen precio
Espectrofotómetro de barrido ultra rápido. Ganador de numerosos premios de diseño Premio a la Excelencia en Ingeniería Premio a la Innovación Revista R&D Premio al mejor desarrollo instrumental IBO

4 Cary 50 La revolución Un instrumento que permite barrer de 190 a 1100 nm en menos de 3 segundos. ( nm /min). Completamente inmune a la luz ambiental. Haz muy estrecho para microcubetas. Especialmente recomendado para cinéticas ultra rápidas: Permite la adquisición de hasta 80 puntos por segundo Ideal para acoplar a Fibra Óptica Un estándar de la espectrofotometría, con gran número de unidades instaladas. Robustez y fiabilidad ampliamente comprobadas.

5 Cary 50 Diseño óptico Lámpara de Xe Alta intensidad Totalmente fría
“Eterna” Sólo ilumina en la medida Corrección de referencia (Doble Haz) Resolución 1,5 nm Elimina la fotodegradación de muestras Cumple con 21CFR P-11

6 Cary 50 Accesorios de Fibra óptica
Acopladores de Fibra óptica Cuantificación sin cubeta Cinéticas en medios complejos Mínima pérdida de sensibilidad Sin mantenimiento Amplia gama de fibras disponible Máxima productividad                            

7 Cinéticas Rápidas Reacciones que se producen en pocos segundos
Requiere muy alta velocidad de medida. Control de temperatura preciso y rápido El CARY 50 aporta las características necesarias: Hasta 80 puntos / segundo Lámpara fria sin calentamiento Compartimento abierto para adición de reactivos Sistema “STOP-FLOW” SFA-20

8 Cary 50: Accesorios multicubetas
Accesorio automático 18 cubetas A temperatura ambiente Termostatizado mediante baño externo peltier Permite la medida de 18 cinéticas inatendidas Paquete con espectrofotómetro muy competitivo Totalmente automático                                                                  

9 Cary 50 Gama de Accesorios
Gama completa de accesorios para muestras sólidas y líquidas

10 CARY 50 TRAYCELL Wavelength range: 220-750nm
Pathlength: 0.2mm or 1.0mm

11 CARY 50 TRAYCELL 260nm peak of DNA 260nm peak of DNA
WinUV DNA/RNA Application Cary 50 + Microcell 400ul DNA Reproducibility +/-0.17%RSD 260nm peak of DNA WinUV DNA/RNA Application Cary 50 + Traycell 4ul DNA Reproducibility +/-0.29%RSD

12 CARY 50 MPR

13 CARY 50 MPR El lector de microplacas Varian CARY 50 combina la alta capacidad de rendimiento de un lector de microplacas con la flexibilidad y grado de desarrollo de un espectrofotómetro. Soluciones de medida para trabajos de rutina e investigación en el laboratorio. Las mayores prestaciones en precisión de temperatura para aplicaciones cinéticas. WinUV Microplate Reader Software que incluye metodos para aplicaciones bioquímicas.

14 CARY 50 MPR especificaciones
Specifications Source High intensity Xenon flashlamp Detectors Silicon photodiode Wavelength range  nm Wavelength selection Czerny-Turner 0.25 m monochromator Wavelength data interval 0.15–5.0 (nm) UV/VIS limiting wavelength resolution < 1.5 nm Wavelength accuracy ± 0.5 nm at nm Wavelength reproducibility ± 0.1 nm Maximum scan rate (single well) 24,000 nm/min Maximum data collection rate (single well) 80 points/sec Photometric range  Abs Temperature range Ambient + 4.0 to 45.0 °C set in 0.1 °C increments Temperature uniformity +/- 0.5 °C Microplate compatibility 6, 12, 24, 48, 96, 384 wells Time to read 96 wells < 50 s Time to read 384 wells < 100 s Operating system Windows XP PRO Recommended PC requirements As discussed

15 Cary 100/300 Instrumentos de máximas prestaciones en el rango medio.

16 Cary 100/300 Diseño Óptico Barrido con Fase de No Medida Optica
Recubierta de Cuarzo Rendija Variable Doble haz Doble Chopper Haz Doble Real

17 CARY 100 UV/VIS Características
Reproducibilidad de barridos a distintas velocidades Sistema óptico de doble haz real Rendija Variable contínua de 0.2 a 4 nm a intervalos de 0.1 nm Rango fotométrico hasta 3.7 Abs Luz difusa a 220nm (%T) Estabilidad fotométrica < Abs/hr Exactitud de long. de onda ± nm Excelente estabilidad para cinéticas Amplio rango de accesorios

18 CARY 300 UV/VIS Características
Reproducibilidad de barridos a distintas velocidades Sistema óptico de doble haz real Premonocromador Rendija Variable contínua de 0.2 a 4 nm a intervalos de 0.1 nm Rango fotométrico hasta 5.0 Abs Luz difusa a 220nm (%T) Estabilidad fotométrica < Abs/hr Exactitud de long. de onda ± nm Excelente estabilidad para cinéticas Amplio rango de accesorios

19 ¿Qué es una cinética? Seguimiento de un proceso de reacción.
Sigue la formación de uno o varios productos. Midiendo la absorción de los mismos frente al tiempo. Permite estudiar los mecanismos de reacción.

20 Control de Temperatura
En todos los casos es necesario termostatizar. Normalmente se utilizan multicubetas. Sistema Peltier control preciso y programable Baño termostático para Tª Constante. Sistema Peltier con rampa de hasta ± 0.06 º C/min Hasta 18 cubetas en Cary-50. Normalmente cubetas termostatizadas por efecto Peltier. Sonda de Temperatura monitoriza las condiciones reales en cubeta PCB-150, baño termostático programable.

21 Cinéticas de Barrido Para monitorizar especies desconocidas.
Realiza gran número de barridos. Obtención directa de la cinética a cualquier longitud de onda Monitorización de varias longitudes de onda simultáneas

22 Cinéticas; cálculo de resultados
En todos los casos se necesita ajustar la curva a una determinada función. Esta función nos indicará el orden de reacción, y el mecanismo de la misma. El Software Cary realiza estas operaciones automáticamente

23 Cinéticas Encimáticas
Caso especial de reacciones catalizadas por encimas Trabajan con un mecanismo de “llave”. E + S ES E + P Solamente se produce la reacción si se combina la Encima (E) con el sustrato apropiado (S). Máxima selectividad. La mayoría de reacciones biológicas se producen de esta forma

24 Importancia de la actividad encimática
Díagnóstico Clínico: La mayoría de enfermedades afectan a la actividad encimática normal. Tras un ataque al corazón, el nivel de CPK aumenta rápidamente hasta un máximo entre las 16 a 36 horas volviendo a valores normales en 3 días. Hay una relación directa entre la actividad encimática y la severidad de la gravedad del ataque. Se suele medir en hígado, corazón, pancrea, músculo, hueso, etc... CPK: Creatina Fosfokinasa

25 Actividad encimática Investigación Bioquímica y farmacéutica:
La mayoría de drogas actúan sobre las encimas. La aspirina actúa inhibiendo la actividad de la encima que cataliza la síntesis de prostaglandinas causantes del dolor. La potencia, y especificidad del medicamento. En investigación pura: Clasificación y síntesis posterior de encimas. Cálculo de Km y Vmax en distintos sustratos Investigación de mecanismos metabólicos

26 Mecanismos Encimáticos
Definidos por la ecuación de Michaelis/Menten v = Vmax[S]/[S]+Km Cada par E/S, se caracteriza por su Km y Vmax El software Cary permite el cálculo directo y automático de éstos valores.

27 Cálculo automático A 260 nm absorben fuertemente ARN/ADN.
A 280 nm absorben proteinas y contaminantes. 260/280= 1.8 ADN PURO 260/280= 2.0 ARN PURO Valores menores indican contaminación

28 1. Warburg, O. and Christian, W. (1942) Biochem. Z., 310, 384.
Warburg-Christian1 Permite medir la concentración de ADN y ARN en mg/mL Introduce factores para cada longitud de onda Corrige el fondo a 320 nm También mide la concentración de proteinas 1. Warburg, O. and Christian, W. (1942) Biochem. Z., 310, 384.

29 Análisis Térmico Proceso de Denaturalización/renaturalización de la doble hélice del ADN. La hipercromaticidad provoca que la cadena simple de ADN absorba más a 260 nm que la cadena doble. Monitorizando Abs (260) vs. Temp. Permite hallar la Tm (Temperatura a la altura media) El valor de Tm es característico de la cadena ADN y permite caracterizar la muestra. Al dismunir la temperatura lentamente la cadena se renaturaliza sin destruir la muestra.

30 Análisis Térmico de ADN
Requiere un control muy preciso de la temperatura. Disponible con el accesorio Peltier en los Cary 100/300/400 Sondas de temperatura para el control preciso Rampas menores de 0.5ºC/min

31 Análisis Térmico El software automático del Cary permite:
Cálculo de derivadas Hipercromaticidad Parámetros termodinámicos Delta S, Delta G, Delta H %GC (Guanina-Citosina) Cálculo de Tm teóricas Corrección de la expansión térmica Normalización a T dada

32 Análisis Térmico (Instrumentación)
Requiere un CARY 100/300 Sistema multiceldas 6*6 peltier Controlador de temperatura Peltier Sondas de temperatura Microceldas

33 CARY UV/VIS/NIR En todos los instrumentos se incluyen:
Documentación de Validación escrita Requerimientos Diseño y desarrollo (DQ) Prestaciones y Operación (Herramientas) (PQ,OQ) Descripción del sistema y Usuarios Cualificación de Instalación (IQ) Plan de Mantenimiento preventivo

34 CARY UV/VIS ¿Validación Sencilla?
El Software Cary Win-UV incorpora, una serie de ayudas a la validación, incluyendo todos los test de las normas internacionales: Farmacopea US Farmacopea Británica Normas de Buena Fabricación (GMP) Tests instrumentales Protocolos de acceso GLP.

35 CARY UV/VIS ¿Validación Sencilla?
Tests completos incorporados en el software. Mediante referencias internas Kits de patrones externos

36 Resúmen y Conclusiones
La espectrofotometría UV/VIS es una herramienta imprescindible en el trabajo bioquímico. Requiere unas características ópticas especiales según el tipo de análisis. Además es necesario disponer de accesorios para control de temperatura y multi-cubetas. Requiere un software especializado al tipo de trabajo habitual en el laboratorio bioquímico

37 Resúmen y Conclusiones
La Gama CARY soluciona todos los requerimientos para el laboratorio bioquímico Excelentes características ópticas Máxima precisión en el control de Temperatura Software enfocado al trabajo bioquímico Facilidad de operación y potencia de cálculo Numerosas herramientas de validación Rango de precios adaptable a sus necesidades