Molecular Biology Techniques

Molecular Biology Techniques
CA García Sepúlveda MD PhD Laboratorio de Genómica Viral y Humana Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Sesiónes #8 y #9 Genes Mapeo de genes
La localización de los genes en el genoma se puede mapear a diferentes resoluciones: Mapa genético de enlace (linkage map) = Baja resolución, 1 Mbp. Mapa de restricción (resolución media) = fragmentos de DNA de 100 a 1000 bp. Mapeo por secuenciación (máxima resolución) = precisión de hasta una base

Sesiónes #8 y #9 Genes Mapa de restricción
Método inicialmente empleado para comparar a dos especies diferentes. El mapa se crea al digerir DNA con diferentes enzimas. Las enzimas poseen especificidades de secuencia distintivas (imagen). La acción de las diferentes enzimas genera fragmentos de DNA de tamaños constantes para un individuo. Polimorfismos de sitios de restricción hacen que algunas enzimas no corten, generando fragmentos de diferente tamaño.

Sesiónes #8 y #9 Genes Secuenciación genómica
Esfuerzo comenzó en 1990 y presentó el primer borrador en 2003. Uno de los proyectos de investigación multinacional más grandes y ambiciosos del mundo.

Sesiónes #8 y #9 Genes Mapa de enlace genético (linkage map)‏
Dos genes que residan en cromosomas diferentes segregarán independientemente, y por ello no se encuentran enlazados. Dos genes que residan en el mismo cromosoma segregarán juntos por lo que se dice que se encuentran enlazados. No obstante el proceso de recombinación genética que nos brinda la beneficiosa biodiversidad provoca intercambios de material genético de dos cromosomas homólogos (No cromátides hermanas!!!). El proceso de recombinación hace posible que dos genes residentes del mismo cromosoma puedan segregar de manera independiente en algunas generaciones (dependiendo de donde se llevó a cabo el evento de recombinación).

Obviamente entre más distantes estén los genes dentro del mismo cromosoma, mayores las posibilidades de ser separados por eventos de recombinación. Entre más cercanos estén, menor la posibilidad de ser separados. Si observamos los patrones de herencia de dos rasgos diferentes se puede estimar la distancia (de manera arbitraria) que separa a los genes que codifican para dichos rasgos.

Los mapas de enlace genético (linkage map) permiten establecer la distancia que separa a dos genes en base a la observación de los patrones de segregación del rasgo codificado por el (en realidad ya ni siquiera hace falta el rasgo, simplemente la presencia del gen por genotipificación). Concepto fue desarrollado por Thomas Hunt Morgan, por lo cual la unidad arbitraria de enlace genético es el Morgan o más comúnmente, el centimorgan.

El centimorgan se define como = la distancia entre genes necesaria para que un producto de meiosis de cada 100 sea recombinante. Una frecuencia de recombinación de 1% es equivalente a 1 cM. En otras palabras, un centimorgan es la distancia que debe separar a dos genes diferentes de un mismo cromosoma (sinténicos) de tal manera en que sean separados por solo 1 de cada 100 eventos de recombinación. Entre más separados (mas centimorgans) los separen, mayor será la tasa de separación de los dos genes. En seres humanos 1 cM equivale a 1Mbp (aunque no para todas las regiones del genoma).

Sesiónes #8 y #9 Genes Mapa de Restricción (RFLP)‏
Se aísla un segmento de DNA para estudiar (plásmido, PCR inespecífica o genérica, etc), para el ejemplo en cuestión digamos de 5000 bp o 5 kbp. Se somete a la acción de dos tipos de enzimas diferentes. Cada enzima corta el DNA solamente en algunas secuencias específicas bien conocidas (típicamente reconociendo secuencias de entre 4 y 6 bp). Las dos reacciones de digestión se corren en un gel (agarosa o acrilamida) de electroforesis. La cámara de electroforesis hace pasar una corriente (desde 50 VDC hasta 4 kVDC) haciendo que los fragmentos de DNA migren hacia el polo positivo (el DNA es negativo por fósforos) en proporción inversa al logaritmo de su peso molecular.

Se revelan dos patrones distintos de digestión para el MISMO fragmento original. Enzima A lo corta en fragmentos de 2100, 1400, 1000 y 500 bp. Enzima B lo corta en fragmentos de 2500, 1300 y 1200 bp. El tamaño de los fragmentos se mide con métodos automatizados (computadoras) o comparando los fragmentos a una escalera de marcadores de peso molecular conocido (centro de imagen). Primer punto relevante: este tipo de mapa brinda información real en bp.

Segunda digestión Para ello extraemos un fragmento del primer gel de tal modo en que tan solo tengamos un fragmento de los generados por la enzima A (digamos, el fragmento de 2100 bp). A este fragmento aislado lo sometemos a la acción de la segunda enzima. La enzima B podrá encontrar en ese fragmento A de 2100 una secuencia de corte (como sucede en la primer y segunda columna de la fig)....o pudiera ser que el fragmento seleccionado no posee ningún sitio de restricción para la segunda enzima (como sucede para la tercera y cuarta columna).

Este segundo paso nos permite lograr mayor resolución...ahora se puede armar el mapa. La digestión del fragmento A-2100 por la enzima B produce dos fragmentos, uno de 1900 bp y otro de 200 bp. Si observamos los patrones de corte logrados con las digestiones mostradas en las columnas 5 a la 7 (fragmentos de B digeridos con enzima A) veremos que algunos fragmentos poseen tamaños similares.

Así tenemos pues que: Fragmento original = 5000 bp Fragmento A-2100 = 2100 bp Fragmento A-2100 digerido con B= B-1900 y B-200 Fragmentos A-1900 mostrado en quinta columna también formaba parte de B Fragmento A-1900 = B-1900 Si empalmamos y agregamos los fragmentos generados por esas mismas reacciones veremos que B-1900 se acompañaba de B-600 y A-1900 de A-200 por ende:

Sesiónes #8 y #9 Genes Mapa de Restricción con marcaje terminal
Hoy en día podemos amplificar nuestra secuencia original (la de 5000 bp) con oligonucleótidos marcados (con radioisótopos o fluorocromos) de tal modo en que se pueda facilitar la identificación de al menos las porciones terminales (5' y 3') del fragmento original una vez digerido. El uso de estos patrones de migración electroforética tras la digestión con enzimas para identificar a individuos con alta capacidad de discernimiento se llama DNA fingerprinting. Restriction Fragment Length Polymorphism = RFLP

Sesiónes #8 y #9 Genes Mapa de Restricción con marcaje terminal
En procariotas el mapa de restricción de DNA es idéntico al mapa de restricción del cDNA. Dada la naturaleza interrumpida de los genes de eucariotas superiores, el mapa de restricción de DNA genómico solamente es similar al del cDNA retro-transcrito en algunas regiones (codificantes). Los intrones, naturalmente incluyen sitios de restricción no presentes en el cDNA. De este modo, el RFLP comparativo (DNA vs cDNA) permite identificar la presencia y número de intrones presentes en un gen. No obstante, algunos intrones o exones pequeños pudieran no ser detectados por este medio si son muy pequeños o si carecen de sitios de restricción, lo que requiere de secuenciación.

Sesiónes #8 y #9 Genes Identificación de genes en base a exones
Debido a que los exones de genes emparentados se mantienen conservados, es fácil detectar la presencia de genes similares en especies animales o vegetales no-caracterizadas a partir de la búsqueda de secuencias similares al exón de interés. Si quisiéramos saber por ejemplo si existen homólogos en animales de determinado gen bastaría con marcar un fragmento exónico del gen conocido y emplearlo para buscar exones relacionados por hibridización con muestras animales /ya sea por FISH o Southern Blot). A esta aplicación específica del Southern Blot se le conoce como Zoo blot. Intentar buscar genes emparentados en otras especies con mRNA es otra alternativa (Northern Blot) pero no nos mostraría otras proteínas que compartan el mismo exon. Por otro lado, la búsqueda de genes emparentados usando fragmentos que contengan intrones no es muy útil ya que sabemos que los intrones no son tan conservados como los exones.

Sesiónes #8 y #9 Genes Captura exonica
Supongamos que hemos identificado un fragmento de DNA grande por Zoo blot o Southern que posee el exón de interés. Recordemos que exones son mucho más pequeños que intrones y encontrar al exón en dicho fragmento será “encontrar una aguja en un pajar”. Una manera fácil de encontrarlo es emplear el método de atrapamiento exónico. Un vector de atrapamiento exónico contiene un promotor fuerte y dos exones separados por un intrón. El vector (una vez introducido en una célula hospedera) será procesado por la maquinaria espliceosomal para eliminar región del promotor y el intrón, pegando a ambos exones.

El intrón del vector posee una secuencia en la cual podemos introducir (clonar) un fragmento de DNA genómico.

El intrón del vector posee una secuencia en la cual podemos introducir (clonar) un fragmento de DNA genómico. Si clonamos un fragmento genómico que no tenga exones, el vector será procesado de manera similar.

En cambio, si le clonáramos un fragmento génico con un exón, la maquinaria de procesamiento espliceosomal reconocería las nuevas fronteras exon-intrón presentes e introduciría (capturaría) al exón presente en el transcrito de RNA procesado.

Secuenciar dicho exón sería cuestión de comenzar con oligonucleótidos localizados en las regiones conocidas del vector.

Sesiónes #8 y #9 Genes Southern Blot
Método inventado por Ewin Southern, por lo cual al ser un epónimo debe llevar mayúsculas a diferencia de los Blots northern, western y southwestern que son derivaciones de la técnica que emplean otros tipos de sondas y muestras. Método molecular para escudriñar la presencia de una determinada secuencia de DNA empleando una secuencia radiomarcada de DNA o RNA conocido como sonda. DNA-problema es digerido con diferentes enzimas de restricción. Separar fragmentos de DNA-problema por peso molecular en electroforesis de gel de agarosa. Fragmentos generados por enzimas independientes se corren en pocillos independientes.

Fragmentos (aun en agarosa) son desnaturalizados con un álcali. Transferir fragmentos a membrana de nylon haciendo pasar buffer de transferencia (se inmovilizan fragmentos de DNA-problema a membrana). Preparar (amplificar) sonda de DNA o RNA-conocido. Desnaturalizar sonda marcada. Hibridizar sondas de DNA o RNA-conocido a fragmentos de electroforesis en membrana de nylon (bañando membrana con sonda marcada). Lavar membrana de nylon (se caerá sonda no hibridizada). Colocar membrana en fotodocumentador (fluorocromos) o sobre película fotográfica (radioisótopos).

Ver imagen y averiguar a que fragmento se unió nuestra sonda marcada. Secuenciar fragmentos necesarios para conocer organización génica del DNA-problema (o quizás nada pegó, en cuyo caso la especie problema no posee dicho gen o exón).

Sesiónes #8 y #9 Genes Northern Blot
Técnica molecular para estudiar la expresión génica desarrollada en 1977 por James Alwine, Kemp y George Stark en Stanford. Similar a Southern Blot pero no es un epónimo, no hay un inventor con el nombre Northern. Fragmentos de RNA extraídos de tejido son sondeados con RNA o DNA-conocido específico para el gen cuya expresión deseamos estudiar. Los fragmentos de RNA-problema son extraídos y separados por electroforesis en gel de agarosa + formaldehido (desnaturalizante) o poliacrilamida +urea. Fragmentos de RNA-problema son transferidos a membrana de Nylon e inmovilizados a membrana con luz UV.

Sesiónes #8 y #9 Genes Northern Blot
Preparamos una sonda de DNA marcada (fluorocromo o radioisótopos)‏ Bañamos membrana de nylon con sonda de DNA en solución de sondeo marcada (hibridización). Lavamos membrana y fotodocumentamos. Los fragmentos de RNA marcados de nuestra membrana permiten identificar las bandas de RNA de la corrida de electroforesis que corresponden a dicho gen. Se cuantifica cantidad de RNA de interés par inferir nivel de expresión. En la modalidad reversa (reverse Northern) el DNA o RNA conocido es inmovilizado en membrada y sondeado con el RNA-problema marcado…microarray.

Sesiónes #8 y #9 Genes Reverse Northern Blot Microarray
Inicialmente poco empleada, actualmente el cimiento para microchips de caracterización de patrones de expresión de miles de genes a la vez.

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