La hibridación permite la detección de secuencias específicas La hibridación de DNA, es la más común entre las técnicas basadas en la secuencia para detectar.

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1 La hibridación permite la detección de secuencias específicas La hibridación de DNA, es la más común entre las técnicas basadas en la secuencia para detectar un gen particular o un segmento de ácido nucleico. Hay muchas versiones del método básico la mayoría usan un fragmento de DNA o de RNA marcado (por ejemplo, con radiactividad), referido como sonda, complementario del DNA buscado. En un método clásico para detectar una secuencia de DNA concreta en una geno teca, se presiona con un papel de nitrocelulosa contra una placa de agar con muchas colonias bacterianas individuales, cada una de las cuales contiene un fragmento de DNA recombinante distinto. Algunas células de cada colonia se adhieren al papel, formando una réplica de la placa. El papel se trata con álcali para romper las células y desnaturalizar el DNA que contienen, el cual permanece unido al papel alrededor de la región donde se formó la colonia. A continuación, se añade al papel la sonda de DNA marcada radiactivamente, que se hibridará solamente con el DNA complementario. Después de lavar la sonda sobrante, el DNA híbrido puede ser detectado por autorradiografía (Fig. 1).

2 Fig. 1

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4 Identificación de un clon con un determinado fragmento de DNA por hibridación La sonda de DNA radiactivo se hibrida con el DNA complementario y se revela por autorradiografía. Una vez identificadas las colonias marcadas, se pueden usar las correspondientes colonias de la placa de agar original como fuente de DNA clonado para posteriores estudios. Frecuentemente, el paso limitante en la detección o en la clonación de un gen consiste en producir una cadena complementaria de ácido nucleico para usarla como sonda. El origen de la sonda depende de lo que se conozca del gen investigado. A veces, puede usarse un gen homólogo, donado a partir de otra especie. Si se ha purificado la proteína producto de un gen, se pueden diseñar y sintetizar sondas a partir de la secuencia de aminoácidos y del conocimiento del código genético (Fig. 2). Cada vez se puede obtener más información sobre las secuencias de DNA en los bancos de datos, que almacenan información sobre la estructura de miles de genes de una gran variedad de organismos.

5 Fig. 2

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8 Diseño de una sonda para detectar el gen de una proteína de secuencia de aminoácidos conocida Debido a que el código genético es degenerado, hay varias secuencias de DNA que pueden codificar una secuencia de aminoácidos determinada. Como no se puede conocer la secuencia de DNA correcta por adelantado, se diseña la sonda para que sea complementaria de la zona de mínima degeneración del gen (el menor número posible de codones). Se sintetizan oligonucleótidos con secuencias selectivamente promediadas, de tal manera que contengan uno de los dos posibles nucleótidos en cada posición de potencial degeneración (sombreados en rojo). En el ejemplo mostrado, el oligonucleótido sintetizado es, de hecho, una mezcla de ocho secuencias diferentes: una de las ocho será totalmente complementaria del gen, y todas ellas tendrán al menos 17 de las 20 posiciones complementarias.

9 Estos análisis han servido tanto para condenar como para absolver sospechosos y para establecer la paternidad con un grado de confianza extraordinario. El impacto de esta tecnología en los procedimientos judiciales continuará creciendo, conforme se llegue a acuerdos sobre las condiciones para su uso y los métodos se divulguen entre los laboratorios forenses. Casos que han permanecido sin resolver, incluso durante décadas, pueden ser investigados con estas técnicas: en 1996 se usó la huella del DNA para confirmar la identificación de los huesos del último zar de Rusia y de su familia, asesinados en 1918.

10 Aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante Generalmente, la clonación de un gen es sólo el primer paso de un proyecto más ambicioso, como puede ser la obtención de grandes cantidades de su proteína producto. Se puede cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína,introduciendo cambios en los pares de bases del gen; esta estrategia puede ser muy útil en el estudio del plegamiento, la estructura y la función de las proteínas. El desarrollo de métodos cada vez más sofisticados para introducir y extraer DNA de todo tipo de células está generando nuevos enfoques para el estudio de la función y la regulación de los genes y para la incorporación de nuevos caracteres en plantas y animales. Ahora nos centraremos en las aplicaciones de la clonación del DNA, empezando por las proteínas producidas por genes donados. A continuación, describiremos los procedimientos de clonación utilizados en diversas células eucarióticas, y acabaremos con una discusión de las potencialidades e implicaciones de esta tecnología. Los genes clonados se pueden expresar Frecuentemente, más que en el gen en sí mismo, el interés reside en su producto, sobre todo si la proteína tiene valor comercial, terapéutico o en la investigación. La comprensión de los fundamentos básicos del metabolismo del DNA, el RNA y las proteínas y su regulación en E. coli, ha hecho posible la expresión de genes

11 clonados para estudiar sus productos proteicos. La mayoría de genes eucarióticos carecen de las secuencias (promotores, etc.) necesarias para su expresión en E. coli; las secuencias reguladoras bacterianas para la transcripción y la traducción deben ser, pues, insertadas en el vector de DNA, en posiciones apropiadas en relación con el gen eucariótico. En algunos casos, los genes clonados se expresan tan eficazmente que el producto proteico puede representar más del 10 % de la proteína celular. Algunas proteínas foráneas pueden matar las células de E. coli cuando las concentraciones son tan altas; en estos casos, se ha de limitar la expresión génica a unas pocas horas antes de recoger las células. Los vectores de clonación que contienen las señales de transcripción y traducción necesarias para regular la expresión de un gen clonado se denomínan frecuentemente vectores de expresión. La velocidad de expresión del gen clonado se controla reemplazando las secuencias reguladoras del propio promotor del gen por versiones más eficientes y convenientes suministradas por el vector. En general, para la clonación se coloca un promotor bien caracterizado con sus elementos reguladores cerca de varios sitios de restricción únicos, de manera que los genes insertados en los sitios de restricción se expresen bajo el control de promotor (Fig. 3).

12 Fig. 3

13 Tipos de secuencias de DNA presentes en un vector de expresión en E. coli Se inserta el gen que se desea expresar en uno de los sitios de restricción del policonector, cerca del promotor, con el extremo que codifica el amino-terminal orientado hacia el promotor. El promotor posibilita una transcripción eficiente del gen insertado y la secuencia de terminación de la transcripción puede en ocasiones mejorar la cantidad y la estabilidad del mRNA producido. El operador permite la regulación mediante un represor con el cual se une. El sitio de unión al ribosoma contiene las señales necesarias para una traducción eficiente del mRNA derivado del gen. El marcador seleccionable permite la selección de las células que contienen el DNA recombinante. Algunos de estos vectores incorporan otras características, como sitios de unión al ribosoma para mejorar la traducción del mRNA derivado del gen, y/o una secuencia de terminación de la transcripción. La sobre expresión de genes clonados en bacterias y otras células puede suministrar grandes cantidades de proteínas importantes para la industria y para la investigación.

14 Bibliografía Nelson David L, Cox Michael M. “ Lehninger Principios de Bioquímica”. Ediciones Omega. 2001