Módulo 6.2 Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Por qué hacer un análisis de la OTA En apoyo a los programas de vigilancia de la OTA Para generar datos sobre los niveles de distribución y contaminación Para permitir la evaluación de las repercusiones de las medidas de prevención y optimizar los programas Para certificar el cumplimiento de los niveles oficiales de OTA o de los requisitos del comprador En apoyo a la investigación orientada a entender mejor el problema y probar soluciones Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Planificación del análisis de la OTA Para realizar los beneficios del análisis de la OTA, los servicios analíticos deben tener La competencia técnica y el equipo necesarios para llevar a cabo los análisis requeridos con los niveles de sensibilidad y cuantificación pertinentes La capacidad de llevar a cabo el volumen de análisis necesarios en el plazo requerido Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Inversión en el análisis de la OTA Instalaciones adecuadas Para reducir al mínimo los peligros profesionales; asegurar un entorno para que el equipo funcione bien y reciba el mantenimiento necesario t Equipo y materiales necesarios Para llevar a cabo los estudios y los métodos oficiales de análisis según se requiera Personal adecuado y calificado Analistas profesionales y expertos; técnicos para mantener y reparar el equipo; personal de apoyo; capacitación regular en el trabajo Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

¿Son aceptables los costos? Promueve la confianza en el sector nacional del café Los programas oficiales de vigilancia y análisis de la OTA, cuya buena cimentación esté comprobada, pueden promover la confianza de los importadores y la posición del país en el comercio internacional Protege a los consumidores del país Protege contra el riesgo de que café de poca calidad se destine al consumo local Recuperación de costos de la industria Es posible recuperar por lo menos una parte de los costos Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Aspectos técnicos de los programas de análisis de la OTA Los principales aspectos de los programas de análisis de la OTA son Los planes de muestreo Métodos de análisis validados Un sistema para garantizar la calidad Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Planes de muestreo para investigar la presencia de OTA en el café La distribución heterogénea de OTA en los lotes de café hace necesario tomar muestras representativas Los planes de muestreo se deben diseñar en relación con el objetivo de la toma de muestras Para tener una unidad representativa a fin de estimar el “todo” Para caracterizar un determinado sector de la población La formulación de planes oficiales de muestreo tiene como objetivo proporcionar métodos internacionales para evitar dificultades surgidas de diferencias jurídicas y técnicas relacionadas con la toma de muestras en el comercio (Codex Alimentarius) Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Establecimiento de métodos de muestreo Los métodos de muestreo para los programas de vigilancia y análisis de la OTA deben especificar Procedimientos para la toma y la manipulación de las muestras El tamaño y el número de incrementos para obtener una muestra representativa Criterios estadísticos para la aceptación y el rechazo de un lote, a partir de la muestra Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Aspectos decisivos del muestreo para el análisis oficial de la OTA El tamaño de la muestra y el número de muestras significan El porcentaje de lotes aceptados a concentraciones inferiores al límite reglamentado (lotes buenos) El porcentaje de lotes rechazados a concentraciones superiores al límite reglamentado (lotes malos) Incertidumbre asociada con el procedimiento de análisis de la OTA Riesgos de los compradores Riesgos de los vendedores Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Requisitos para los métodos oficiales de análisis Validación Precisión Posibilidad de repetir los resultados (en y entre laboratorios) En el margen de criterios de desempeño mínimo establecidos Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Características principales de los métodos oficiales de análisis Exactitud Aplicabilidad Límites de detección y determinación Linealidad Precisión Recuperación Selectividad Sensibilidad Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

¿Quién decide en los métodos oficiales de análisis? Los métodos validados pueden adoptarse como métodos oficiales por El Codex Alimentarius AOAC International Normas nacionales e internacionales Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Selección de métodos cuando no hay métodos oficiales o no son aplicables Validación interna, de acuerdo a las Recomendaciones armonizadas de la IUPAC para la validación de métodos de análisis en un solo laboratorio Método comprendido en la norma ISO/IEC 17025:1999 o principios de buenas prácticas de laboratorio Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Métodos oficiales Métodos internacionalmente validados en colaboración mediante protocolos internacionales armonizados Café tostado, Entwisle et al. 2001; AOAC 2000.09; CEN EN 14132:2003  Café verde, Vargas et al. 2005; AOAC 2004.10 En el sitio web de la AOAC no se ha anunciado algún método oficial de análisis de la ocratoxina A Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Diagrama de circulación del análisis de la OTA Diagrama de los pasos generales de la toma de muestras, preparación de las muestras y análisis de la presencia de micotoxinas en los productos agrícolas Preparación de la muestra MUESTREO Muestra de prueba Lote Extracción Separación y cuantificación Purificación Análisis para determinar la presencia de OTA MOLIDO Y HOMOGENEIZACIÓN Toma de muestras secundarias Resultado de la prueba de micotoxinas Garantía de calidad analítica Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Evaluación de los métodos de análisis de la OTA Hay criterios funcionales importantes Exactitud y posibilidad de repetición Hay consideraciones prácticas significativas Velocidad del análisis Cualitativo o cuantitativo Preparación necesaria para hacer el ensayo Costos iniciales y recurrentes Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Pasos del análisis de la OTA: preparación de las muestras Es un paso de primera importancia en el procedimiento analítico Requiere tiempo Molido Homogeneización Preparación de la pasta Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Pasos del análisis de la OTA: la extracción El solvente específico depende de la matriz o de los pasos de purificación y cuantificación Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Pasos del análisis de la OTA: la extracción Recuperación de la verdadera concentración de las micotoxinas es un punto crítico Solvente orgánico en presencia de ácido o un solvente de extracción que contenga bicarbonato de sodio acuoso Batidora o mezcladora de alta velocidad Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Pasos del análisis de la OTA: purificación Supone en esencia Separar la micotoxina de las sustancias que se extrajeron con ella Paso inicial de la concentración Métodos de purificación Los procedimientos comunes requieren tiempo y son laboriosos Inmunoafinidad con sorbentes para extracción de fase sólida (EFS) Un importante método Proporciona métodos muy selectivos Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Pasos del análisis de la OTA: purificación Columna de inmunoafinidad en la purificación del café verde Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Pasos del análisis de la OTA: separación, detección y cuantificación Los métodos disponibles son Cromatografía de líquidos con detector de fluorescencia (CL/fluoresencia) Cromatografía en capas delgadas (CCD) Prueba de inmunosorción enzimática (ELISA) Fluorimetría Dispositivos de flujo lateral Inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA) Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Pasos del análisis de la OTA: separación, detección y cuantificación Nuevos enfoques analíticos Métodos de análisis rápidos y económicos Basados en biosensores Kits de tiras reactivas Cromatografía de líquidos aunada a Espectrometría de masas por ionización de haz de electrones (MS) Espectrometría de masas en tandem o secuencias (MS/MS) Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

La cromatografía de líquidos en el análisis de la OTA Principales ventajas Posibilidad de automatización Poder de separación Selectividad Límites más bajos de detección (0,12-0,2 g/kg) Principales desventajas Método costoso Requiere analistas y técnicos calificados Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

La cromatografía de líquidos en el análisis de la OTA Detección y cuantificación Cromatograma de una solución normal de OTA a una concentración de 0,0218 µg/ml. Fase inversa 250x4,6 mm – 0,5µm. Detector de fluorescencia. Fase móvil: acetonitrilo: metanol: agua: ácido acético (35+35+29+1). Caudal: 0,8mL/min. Procesador automático de muestras Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

La cromatografía en capas delgadas en el análisis de la OTA Técnica robusta, sencilla, veloz, económica Principales ventajas Relativamente económica considerable competencia y experiencia en los países en desarrollo utilizada en aplicaciones de rutina Columna de inmunoafinidad Extractos de muestras libres de interferencias mayores de la matriz adecuada para el análisis dimensional de CCD mejora: la sensibilidad, separación, resolución y visualización Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

La cromatografía en capas delgadas en el análisis de la OTA Confirmación de la presencia de OTA a través de la CCD Rociar las láminas de ccd con cloruro de aluminio y bicarbonato de sodio Exponer las placas a vapor de amonio Se ha confirmado la CCD en FI como método para la detección de OTA en el café Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

La cromatografía en capas delgadas en el análisis de la OTA Principales desventajas de la CCD Costo elevado de los fluorodensitómetros comerciales La cuantificación sigue siendo una limitación Habilidad de los analistas para cuantificar visualmente la toxina Falta de resolución Poca sensibilidad Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

La cromatografía en capas delgadas en el análisis de la OTA Muestras normal y naturalmente contaminadas por OTA, disueltas con tolueno ácido acético (99:1, v/v) y detección en placa normal de CCD Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Métodos de detección para el análisis de la OTA Principales ventajas Métodos rápidos de prueba Fáciles de usar El análisis se puede llevar a cabo sobre el terreno Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Métodos de detección para el análisis de la OTA Limitaciones Respuesta cualitativa: sí o no hay contaminación Resultados negativos falsos Necesidad de confirmación de los resultados positivos Desventajas Elevado costo recurrente Falta de atención respecto a la condición de la extracción de las muestras Tendencia a no tener en cuenta los requisitos de las muestras Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Métodos de detección para el análisis de la OTA Kits de análisis para detección en el café Compuesto Empresa Producto Reconocimiento Matrices primarias ocratoxina r - Biopharm GmbH RIDASCREEN OTA Column Granos de café VICAM OchraTest OTA TECNA S.r.l. Immunoscreen OCHRA Cereales, piensos , vino, café verde y cacao Tepnel BioSytems Ltd. BioKits OTA Assay Cereales, fruta seca, , y vino blanco OTA y B Romer Labs AgraQuant OTAssay (2 40ppb) Cebada, trigo, café verde, maíz, soya y trigo AgraQuantR Ochratoxin (2 40 ppb) ELISA Test Kit Trigo, maíz, cebada, Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

El método ELISA en el análisis de la OTA Popular y útil instrumento de detección gracias a la disponibilidad de anticueros policlonales y monoclonales contra la OTA Ventajas del sistema ELISA Sencillez Número de muestras que se pueden analizar al mismo tiempo Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

El método ELISA en el análisis de la OTA Desventajas del sistema ELISA Menos exacto y sensible Se encontraron muy pocas correlaciones (tradicionales) Resultados positivos o negativos falsos No se debe usar como método cuantitativo Sólo se debe usar con alimentos en los que se ha experimentado ampliamente y cuya eficacia se ha demostrado En cada prueba deben utilizarse suficientes controles Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Métodos de espectrofluorimetría para el análisis de la OTA Suponen Utilizar columnas de inmunoafinidad con fluorómetro Principales desventajas Tasas mayores de resultados positivos y negativos falsos Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA

Garantía de calidad del análisis de la OTA Garantía de calidad analítica Son esenciales programas para garantizar resultados fidedignos Donde se requiere aceptabilidad internacional, es importante la acreditación Se proporciona orientación detallada sobre garantía de calidad analítica para el análisis de la OTA en la sección de documentación de apoyo del módulo 5.2 de este CD-Rom Módulo 6.2 - Análisis de la OTA: Un aspecto importante de los programas de prevención contra la OTA