Efecto de la suplementación con Vitamina A en la producción de citoquinas durante la infección malárica Viviana Milena Taylor Orozco MSc. Ciencias Básicas Biomédicas Coautores Rosa M. Uscátegui P. Claudia M. Velásquez R. Jaime Carmona F. Luis Carlos Burgos H. Tópicos Selectos de Infectología 2009 Infecciones Gastrointestinales y Simposio de Nutrición e Infección Grupo de Investigación en Alimentación y Nutrición Humana Grupo Salud y Comunidad Universidad de Antioquia 2009

Prevalencia de desnutrición Malaria y desnutrición En Colombia, 2006 89.794 casos de malaria 39 muertes. Antioquia 41.012 (46%) 5.674 Turbo (14%): P. vivax (4.956), P. falciparum (705) y mixta (13) 1. Grupo poblacional Prevalencia de desnutrición < 1 unidad Z Niños palúdicos de Turbo 5-9 años. Aguda: 24 % 2 Crónica: 57 % Niños Palúdicos Turbo- Bagre y Zaragoza 3-11 años. Aguda: 33% 3 Crónica: 52% Urabá Antioqueño niños 0-10 años. Aguda: 15% 4 Crónica: 53% 1 Eventos de interés en salud publica, Antioquia 2006. [Consultado: 18 de octubre de 2007]. Disponible en: http://www.dssa.gov.co/dowload/EInteresSPVer2007.xls. 2 Uscátegui et al. Biomédica. 2007. 3 Blair et al. An pediatr. 2003. 4 Álvarez et al. Perfil alimentario y nutricional Urabá. 2005.

Parásitos intestinales, anemia y retinol bajo. En niños palúdicos Hallazgo 4-11 años del Bagre, Antioquia. 65% retinol.1 4-10 años del Bagre y Turbo. 85% Parásitos intestinales y anemia. 2 Interacciones sinergistas y antagonistas Plasmodium y Helmintos3. 1 Blair et al. Pan Am J Public Health. 2002. 2 Uscátegui et al. Biomédica. 2007 3 Nacher M.. Parasite Immunol. 2002.

Malaria Respuesta TH1/TH2 Parasitosis intestinal Retinol bajo Anemia

Citocinas TH1/TH2 y malaria IgG1 TNF-α IFN-g IL-4 IL-10 TGF-β Parasitemia Efectos inmunopatogénicos Macrófagos IL-12 ON 5 10 15 20 25 30 35 40 45 días post-infección Th1 Th1,Th2 Th2 Su Z et al. Infect immun. 2000;68(8):4399-406.

Retinol y Citocinas TH1/TH2 In vitro RXR y RA importante en la diferenciación TH0 a TH2 y suprimen el desarrollo TH11,2. Microglia y astrocitos de ratones ácido retinoico NO y citocinas proinflamatorias (TNF-α. IL-12, IL 1β)3. Monocitos (LPS) RA IL-10 y IL-12 y TNF-α 4. In vivo Ratones carentes RXR respuesta TH1 exagerada: - Alteraciones en las células presentadoras de antígenos - Función en las células TCD4+5. 1 Spilianakis C et al. Eur J Immunol. 2005. 2 Stephensen ChB et al. J Immunol. 2002. 3 Hoag K.A et al. Nutritional immunology. 2002. 4 Wang X et al. J Immunol. 2007. 5 Xu J et al. J Neuroimmunol. 2006.

La susceptibilidad se revierte al suplementar con vitamina A1. Retinol y malaria In vivo Deficiencia retinol Exacerba la malaria La susceptibilidad se revierte al suplementar con vitamina A1. In vitro Ácido cis retinoico RXR Macrófago CD36 Glóbulo rojo parasitado Reduce producción exagerada de citoquinas proinflamatorias 2 . 1 Stoltzfus RJ et al. J Nutr, 1989. 2 Serghides L et al. Lancet, 2002.

RESPUESTA TH1/TH2 Parasitosis intestinal, malaria, anemia y desnutrición Grupo de edad Hallazgo Adultos con malaria aguda. TNF-α, IL-1 e IL-6: suprimen síntesis de eritropoyetina, alta parasitemia y anemia1. Niños palúdicos de Kenya y Colombia Menores de 9 años. > IL-10/TNF-α: Sin anemia grave activación de linfocitos T, aumento en la producción de anticuerpos e inhibición de la respuesta TH12. Niños menores de 6 años desnutridos agudos o crónicos. desnutridos infectados: TH2 (helmintos). desnutridos sin infección: TH13. 1 Vedovato M et al. Nephrol Dial Transplant 1999; 14(4): 1043-1044 2 Nussenblatt V et al. Clin Diagn Lab Immunol. 2001; 8(6): 1164-1170. 3 Sauerwein RW et al. Am J Clin Nutr 1997; 65:1534-1539.

Suplementos de retinol en malaria Estudio doble ciego placebo controlado con suplementos poblacionales de vitamina A en Papua Nueva Guinea (P. falciparum). In vivo Deficiencia de retinol (infección) TH1. Ratones sin deficiencia TH2. In vitro Tres efectos sobre TH1/TH2: Regulación directa IFN-γ Disminución actividad de CPA. Crecimiento o diferenciación de células TH21. 1 Cantorna, M et al. J Immunol. 1994.

Pregunta de Investigación ¿Cuál es la influencia que tiene un suplemento de retinol en la respuesta de citocinas TH1/TH2 en niños que posteriormente presentan malaria?

OBJETIVOS General: Evaluar en niños con malaria por P. vivax no complicada, el efecto un suplemento de retinol brindado 6 meses antes, sobre las citocinas TNF- α, IFN-γ , TGF-β1, IL-10 y de inmunoglobulinas G (IgG) y E (IgE).

OBJETIVOS Específicos: Comparar las concentraciones de TNF- α, IFN-γ, TGF-β1 e IL-10 entre el grupo con retinol y el grupo control sin retinol. Comparar las concentraciones de IgE y G específicas contra malaria entre el grupo con retinol y el grupo sin retinol.

OBJETIVOS Específicos: Comparar la frecuencia e intensidad de inflamación (indicada por la PCR y ferritina), de anemia (indicada por la hemoglobina) y de deficiencia subclínica de vitamina A (indicada por el nivel de retinol) entre el grupo con retinol y el grupo sin retinol. Dentro de cada grupo del estudio, correlacionar las variables PCR, ferritina, retinol, hemoglobina, citocinas e IgE y G.

METODOLOGÍA _______________________________________________________ niños 0,5-15 años, El Tres- Turbo: la mitad había recibido suplemento de retinol en 4 ocasiones c/3 meses _______________________________________________________ niños con malaria vivax no complicada según OMS1 niños que no recibieron suplemento de retinol 25 niños que recibieron Suplemento de retinol Grupo con retinol 25 niños pareados por edad, sexo y vereda de residencia. Grupo sin retinol Se controló por estado nutricional y parásitos intestinales análisis estratificado. 1 López F, Schmunis G. (editores). Diagnóstico de malaria In: OPS-OMS, Pub Cient 512. Washington, 1988.

Ig G e Ig E específica contra malaria Citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, TGF-β. Se determinaron en suero, por la técnica de ELISA, kit comercial R&D system. Ig G e Ig E específica contra malaria Se determinaron en suero, por la técnica de ELISA usando antígeno crudo de P. falciparum. Proteína C reactiva (PCR) Se midió en suero por Turbidimetría. Inflamación si concentración > 8 mg/L. Ferritina Se midió en suero, con la técnica de enzimoinmunoanálisis de micropartículas (MEIA).

Hemoleucograma Retinol Coprológico Por cianometahemoglobina en equipo automatizado. Se clasificó anemia según criterios OMS por hemoglobina. Retinol Se midió en plasma por HPLC . Deficiencia subclínica de vitamina A: <20 µg/dL. Coprológico Examen directo y por concentración con formol-éter. Se consideró positivo si hubo presencia de parásitos gastrointestinales patógenos Helmintos: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Ancylostoma duodenale y Strongyloides stercoralis. Protozoos: Entamoeba histolytica y Giardia lamblia.

Evaluación antropométrica Se usaron equipos y técnicas de uso internacional Población referencia NCHS 1977, OMS Se construyeron: indicador T/E e índice de Masa Corporal 1 T/E: talla para la edad (desnutrición crónica) Desnutrición crónica: <1 unidad Z. IMC: índice de masa corporal (desnutrición aguda) Bajo peso ( < percentil 15). 1 Lohman TG et al. Anthropometric standardization reference manual. Champaign: Human Kinetics Books; 1988.

RESULTADOS Tabla 1. Características de los niños según grupo de tratamiento. Variable Grupo con retinol (n=25) Grupo sin retinol p 1Peso en Kg (X ± DE) 28±10 30±13 0,621 1Talla en cm (X ± DE) 127±20 131±20 0,567 1Parasitemia (P/μL) 5557±4350 5830±3901 0,574 2Con desnutrición crónica (T/E) (si/no) 17/8 15/10 0,384 2Peso bajo según IMC (si/no) 6/19 4/21 0,363 2Coprológico positivo (si/no) 19/4 20/4 0,625 2Helmintos (si/no) 10/13 17/7 0,054 2Protozoos (si/no) 17/6 0,536 1 p según la prueba U de Mann-Whitney. 2 p según la prueba Chi cuadrado.

Con retinol Sin retinol Tabla 2. Comparación de las variables bioquímicas e inmunológicas en niños según grupo de tratamiento. Con retinol Sin retinol 1p Variable n X ± DE Mediana PCR ( mg/L) 25 29±25 24 48±39 36 0,070 Hemoglobina (g/dL) 23 10,5±1,5 10,3 11,2±1,8 11,1 0.054 Ferritina (μg/L) 143±191 105 154±108 113 0,160 Retinol (μ/dL) 16,9±1,8 16,3 17,2±2,3 17,0 0,786 IL-10 (pg/mL) 20 275±283 112 233±253 125 0,989 TNF-α (pg/mL) 32,2±66,3 5,5 16,2±49,2 0,0 0,162 IFN-γ (pg/mL) 49,1±60,2 29,3 68,5±80,3 31,1 0,473 IgE (DO) 0,418±0,213 0,417 0,481±0,221 0,312 0,377 IgG (DO) 0,823±0,516 0,612 0,623±0,330 0,524 0,290 1p según la prueba U de Mann-Whitney, excepto hemoglobina y el retinol que se hizo por la prueba T pareada.

Deficiencia subclínica de vitamina A 1 Tabla 3. Comparación de frecuencia de inflamación, anemia y deficiencia subclínica de vitamina A, según grupo de tratamiento. Categoría Con retinol (n=25) Sin retinol 1p Inflamación (si/no) 84% 92% 0,334 Anemia (si/no) 96% 79% 0,104 Deficiencia subclínica de vitamina A 1 1p según la prueba Chi cuadrado

Estratificación por estado nutricional y parasitosis intestinal Grupo con retinol (n=25) Grupo sin retinol Estrato 1: no desnutridos ni parasitados 2 Estrato 2: desnutridos no parasitados Estrato 3: no desnutridos y parasitados 5 7 Estrato 4: desnutridos y parasitados 13 14

Tabla 4. Comparación de las citocinas e inmunoglobulinas en el estrato de niños desnutridos crónicos y parasitados, según grupo de tratamiento. Con retinol (n=13) Sin retinol (n=8) 1p Variable X ± DE Mediana IL-10 (pg/mL) 283±289 112 186±219 119 0,827 TNF-α (pg/mL) 43,7±82,7 0,0 31,9±74,3 0,5 0,876 IFN-γ (pg/mL) 34,5±25,1 24,5 85,4±79,7 45,0 0,218 IgE (DO) 0,382±0,116 0,391 0,338±0,221 0,30 0,190 IgG (DO) 0,844±0,60 0,643 0,596±0,317 0,537 0,232 1p según la prueba U de Mann-Whitney.

Con retinol Sin retinol Tabla 5. Comparación de intensidad de inflamación, anemia y deficiencia subclínica de vitamina A, en el estrato de niños desnutridos crónicos y parasitados, según grupo de tratamiento. Con retinol Sin retinol Variable n X ± DE Mediana 1p PCR ( mg/L) 14 30±25 25 13 47±31 38 0,089 Hemoglobina (g/dL) 12 10,5±1,1 10,7 11,6±2,2 11,5 Ferritina (μg/L) 117±72 110 184±127 145 0,058 Retinol (μ/dL) 17,0±2,1 16 17,3±2,5 17 0,698 0,120 1p según la prueba U de Mann-Whitney excepto para hemoglobina y retinol que se hizo por la prueba T pareada.

Con retinol (n=14) Sin retinol (n=13) 1p Tabla 6. Comparación de frecuencia de inflamación, anemia y deficiencia subclínica de vitamina A, en el estrato de niños desnutridos crónicos y parasitados, según grupo de tratamiento. Categoría Con retinol (n=14) Sin retinol (n=13) 1p Inflamación (si/no) 93% 100% 0,519 Anemia (si/no) 92% 69% 0,186 Deficiencia subclínica de vitamina A 86% 0,529 1p según la prueba Chi cuadrado

Grupo con retinol Grupo sin retinol Correlaciones entre grado de parasitemia, variables inmunológicas y bioquímicas en el estrato de niños desnutridos crónicos y parasitados, según grupo de tratamiento. Grupo con retinol Grupo sin retinol r= 0,381 p=0,108 r= 0,696 p=0,008 Ferritina µg/L Ferritina µg/L IL-10 pg/mL IL-10 pg/mL r=0,219 p=0,367 r= 0,580 p=0,006 Ferritina µg/L Ferritina µg/L IFN-γ pg/mL IFN-γ pg/mL

Comportamiento de las variables bioquímicas e inmunológicas del estudio Hallazgo Variable Grupo con retinol Grupo sin retinol PCR Hemoglobina Ferritina Retinol TNF-α IFN-γ IL-10 IgE e IgG Sin cambios

DISCUSIÓN Desnutrición crónica y aguda superior a lo encontrada en estudios poblacionales Urabá1,2. Prevalencia de parásitos intestinales 83% 85%2. Pequeño tamaño muestral y alta variabilidad de los datos (rangos de edad amplios). En el grupo con retinol concentraciones más bajas de PCR y ferritina efecto antiinflamatorio3. Menor intensidad en la inflamación no reflejado en las concentraciones de citocinas. 1 Álvarez MC, et al. Perfil alimentario y nutricional de los hogares de la región del Urabá antioqueño. Universidad de Antioquia, 2005. 2 Uscátegui RM, et al. Estado nutricional en niños maláricos residentes en El Bagre y Turbo. Biomédica 2007. 3 Hurt N, Smith T, et al. Do high levels of C-reactive protein in Tanzanian children indicate malaria morbidity. Clin Diagn Lab Immunol 1994.

Valores de IL-10 altos más capacidad de modular la respuesta inmune complicaciones en la malaria (mejor pronóstico) 4. No diferencia en prevalencia de anemia y deficiencia subclínica de vitamina A (grupos de tratamiento con/sin estratificación). Correlaciones: papel TNF-α, comportamiento de la ferritina como proteína positiva de fase aguda y regulación de IL-10 sobre las citocinas proinflamatorias. Hallazgos que justifican realizar estudios de este tipo: 1. Valores más bajos de PCR y ferritina en el grupo sin retinol. 2. Concentraciones más bajas de hemoglobina grupo con suplemento. 3. Correlación positiva entre IFN-γ y hemoglobina. 4 Riley EM, et al. Regulating immunity to malaria. Parasite Immunol 2006.

“Contribuir a aclarar el panorama efecto del retinol en niños palúdicos y pertinencia de administrar suplementos poblacionales, como estrategia dirigida al control de la malaria”.