TRABAJO PRÁCTICO N° 2 MEDIOS DE CULTIVO SIEMBRA Y TRANSPLANTE Lic.Soria Josè

MEDIOS DE CULTIVO. Definición: es toda preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energía y condiciones ambientales adecuadas para el desarrollo y la supervivencia del microorganismo.

Los cultivos pueden ser: a) puros o axénicos b) mixtos CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo. Los cultivos pueden ser: a) puros o axénicos b) mixtos Existe gran diversidad de condiciones químicas y físicas en las cuales puede ocurrir el crecimiento microbiano, pero siempre se requieren una fuente de energía y una fuente de carbono Un solo tipo de microorganismo Varios tipos de microorganismo

Clasificación de Microorganismo según su fuente de energía y fuente de carbono

Composición de los medios de cultivos 1. Elementos energéticos y constitutivos a) Macro elementos b) Micro elementos o trazas c) Factores de crecimiento 2. Agua 3. Agentes solidificantés:

1. Elementos energéticos y constitutivos a) Macro elementos CO2 para autótrofos, Fuente de Carbono azúcares para heterotrofos “Se necesita el carbono para la construcción de muchas moléculas necesarias para la célula” NO3-, NH3 ó N2. (autótrofos) Fuente de nitrógeno Aminoácidos y proteínas “El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared”

1. Elementos energéticos y constitutivos a) Macro elementos Fuente de: Se adiciona como: La célula lo utiliza para: SO42-, tiosulfato o sulfuro Producir aminoácidos (cisteína y metionina) y diferentes coenzimas Azufre Funciona como Buffer Para producción de ATP, fosfolipidos y Ac Nucleicos Fósforo Fosfatos de sódio o potasio calcio, magnesio y potasio sales inorgánicas Co factores de enzimas Estabiliza la presión osmótica sodio Na Cl

1. Elementos energéticos y constitutivos b) Micro elementos o trazas Son metales que se requieren en muy pequeñas cantidades. Participan en la estructura de las enzimas, vitaminas, transportadores de electrones como citocromos. Son contaminantes de los macroelementos y se incorporan junto a ellos en los medios de cultivo. Frecuentemente esenciales: Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.

1. Elementos energéticos y constitutivos b) Factores de Crecimiento Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentraciones y que no pueden ser sintetizados por la célula Si la secuencia de producción enzimática, de un determinado componente. (Por ej: Histidina) esta interrumpida por alguna alteración, este componente no podrá sintetizarse por la célula y se convertirá en un factor de crecimiento. Ejemplos de factores de crecimiento : vitaminas, como las del complejo B algunos aminoácidos ,purinas y pirimidinas

2. Agua El agua representa el 80-90% del peso total de una célula Es fundamental para la realización de todos los procesos metabólicos Funciones enzimáticas, solvatación de materiales orgánicos e inorgánicos, y donación de electrones para organismos fotosintéticos En los medios de cultivo se usa agua destilada, libre de iones como Ca2+ y Mg2+

3. Agentes solidificantés Cuando se agregan a un medio de cultivo permiten aislar colonias bacterianas. El mas utilizado es el Agar. Su uso es opcional El agar se enfría y se solidifica Permite aislar Colonias bacterianas Placa de petri Se adiciona el medio de cultivo con agar fundido

El Agar es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato. Se usa sin problemas en medios de cultivo porque las bacterias NO lo digieren. Sus características: Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C. Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la mayoría de las bacterias patógenas del hombre. No es tóxico para las bacterias Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula), lo que resulta imposible en medios líquidos!! - Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.

Condiciones Físicas de un medio de cultivo mesófilos: 35-37°C psicrófilos: 15-20°C termófilos: 50-60°C Temperatura aerobios estrictas: requieren oxígeno para crecer. b) anaerobios obligados: el O2 les resulta tóxico. c) anaerobios facultativos: pueden crecer tanto en condiciones aerobias como en condiciones anaerobias d) microaerófilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una atm enriquecida en CO2. e) anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2 y si son expuestos al O2 no mueren. Presencia de oxígeno presión osmótica la mayoría de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl luz: es importante para los microorganismos fotosintéticos Humedad: Los microorganismos necesitan un ambiente húmedo para su desarrollo pH: la mayoría de las bacterias crece en medio neutro o levemente alcalino

Ej: medios para quimioheterotrofos CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Por su origen químicamente definidos o sintéticos naturales o complejos Su composición química se conoce con exactitud, cada componente es de alta pureza analítica y realiza un aporte específico ej: medios para autotrofos Se preparan a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal de composición química no rigurosamente constante: leche, suero, macerado de maíz,etc Ej: medios para quimioheterotrofos

Extracto de carne ………….. 0.3 g NaCl ………………………… 0.5 g Ej. Medio Definido para fototrofos: CO2 ……………………….. (fuente de C) NaNO3 …………………… (fuente de N) Na2SO4 ……………………. (fuente de S y Na) KH2PO4 ……………………. (fuente de P y K) Trazas ……………………… varias H2O ………………………… (indispensable para toda función celular) Conjunto de sales, Especificas Para un determinado tipo de microorganismo Ej- agar nutritivo (para bacterias quimioorganotrofas) Peptona de carne ………….. 0.5 g Extracto de carne ………….. 0.3 g NaCl ………………………… 0.5 g Agar ……………………… 1.5 – 2 g Agua destilada ……………. 100 ml Aditivos que no tienen una Composición nutritiva definida

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Por su Consistencia Líquidos sólidos semisólidos o blandos No contienen solidificante y no permiten el aislamiento de colonias Incluyen agar en concentraciones de 1.5 a 2% incluye agar al 0.3%

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Por su Composición Comunes Enriquecidos Tienen una alta calidad nutritiva por el agregado de componentes muy ricos como leche, sangre, huevo, líquido, etc. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes incluyen una fórmula nutritiva básica que permite el crecimiento de microorganismos poco exigentes.

Medios de enriquecimiento: CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Por su función: Medios de enriquecimiento: Medios selectivos Medios diferenciales son medios líquidos que favorecen la multiplicación de un determinado microorganismo. son medios sólidos que favorecen la multiplicación de un determinado microorganismo. permiten discriminar entre diferentes tipos de bacterias basándose en características metabólicas particulares de cada uno.

PARTE B: SIEMBRAS Y REPIQUES Siembra: se entiende por siembra al acto de transferir o colocar un microorganismo en un medio de cultivo adecuado. La transferencia se efectúa desde el hábitat natural (nicho ecológico) al medio de cultivo. Muestras Medio de cultivo

Trasplante o repique: es la transferencia de gérmenes desde un medio de cultivo a otro. ¿Con qué se siembra? Ansas en anillo y un ansa recta Crecimiento de Colonias bacterianas Siembra en placa con medio solido

¿Con qué se siembra? Micropipeta o Pipeta pasteur Espátula de Drigalski Siembra Crecimiento de Colonias bacterianas Micropipeta Pipeta pasteur

Técnica aséptica para siembras y repiques La "Técnica aséptica" tiene un doble objetivo: a) evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes de las muestras o cultivos y b) evitar la contaminación de las muestras y cultivos con microorganismos procedentes del ambiente o del propio operador A- se esteriliza el ansa a la llama B- se sostiene el ansa con el índice . Luego con el meñique . se destapa el tubo de muestra .

C. Se flamea la boca para evitar Contaminación D- se sumerge el ansa para tomar Un inoculo del tubo E- se flamea el tubo, para Evitar su contaminación F- se tapa con el dedo meñique