Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de febrero de 2009 La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe

HPN Definición Enfermedad clonal adquirida de la célula hematopoyética pluripotencial Mutación somática en el gen PIG-A (fosfatidil-inositol-glucano de clase A) implicado en la síntesis de glucosilfosfatidilinositol (GPI) Carencia total o parcial de la expresión de proteínas ancladas a la membrana a través del componente GPI en parte de la células hematopoyéticas

HPN Alteración genética: Gen PIG-A Bloqueo en la HPN Uno de los más de 20 genes implicados en la síntesis de las proteínas ancladas a GPI Se encuentran mutaciones del gen PIG-A en todos los casos en que se ha interrumpido la síntesis de GPI Como consecuencia de la mutación se reduce o falta la expresión de proteínas ancladas a la superficie de la célula por moléculas de GPI PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

HPN Proteínas ancladas a GPI Enzimas: acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina granulocítica Moléculas de adhesión: CD48, CD58, CD66b-c Proteínas reguladoras del complemento: CD55: factor que acelera la degradación de las convertasas del complemento (DAF) CD59: inhibidor de membrana de la lisis reactiva (MIRL) Receptores: CD14, CD16, CD87, CD90 Antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios Antígenos del neutrófilo Otros: CD24, CD52 Hernández-Campo et al. Med Clin. 2008; 131: 617-630

Distribución de las proteínas ancladas a GPI CD55 CD58 CD59 PrPC AChE JMH Ag Dombroch HG Ag Células B CD24 CD55 CD58 CD59 CD48 PrPC CD73 CD108 Células progenitoras hematopoyéticas Hematíes CD55 CD58* CD59 CD48 CD52 CD87 CD108 PrPc ADP-RT CD73 CD90 CD109 CD16* Células T CD55 CD58 CD59 CD109 PrPC GP500 Gova/b Plaquetas CD59, CD90, CD109 CD55 CD58* CD59 CD14 CD16 CD24 CD48 CD66b CD66c CD87 CD109 CD157 LAPNB1 PrPC p50-80 GPI-80 ADP-RT NA1/NA2 Células NK Monocitos CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 PrPc CD16 (Cortesía de Lucio Luzzatto) PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK PMN CD14 CD55 CD58* CD59 CD48 CD52 CD87 CD109 CD157 Grupo 8 PrPC GPI-80 CD16

Déficit de proteínas GPI: hemólisis intravascular La reducción o ausencia de CD55 y CD59 en la superficie de los eritrocitos los hace muy vulnerables a la acción del complemento y provoca su destrucción CD55 (DAF): previene la formación de complejos C3-C5-convertasa esenciales para la amplificación de la secuencia de activación de las proteínas del sistema de complemento CD59 (MIRL): inhibe la formación del complejo de proteínas del sistema del complemento C5b-C9 de ataque de membrana Déficit de CD59: formación de poros en la membrana y muerte celular

HPN Cascada del Complemento Vía alternativa Complejo de ataque a la membrana CD59 Vía clásica CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

HPN Tipos de hematíes según sensibilidad al complemento HPN tipo I: sensibilidad normal a la acción del complemento HPN tipo II: sensibilidad intermedia (3-5 veces superior a la normal). Déficit parcial de CD59 HPN tipo III: sensibilidad elevada (15-25 veces superior a la normal). Déficit total de CD59 Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 736-748 Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 749-757

HPN Incidencia y prevalencia Enfermedad rara, pero grave Incidencia: 1,3 casos por 1.000.000 habitantes y año Prevalencia: 7-16 casos por 1.000.000 habitantes Afecta igual a hombres y mujeres Hill A et al. Blood 2006; 108: A985

HPN Historia Natural Gran Bretaña Francia USA Japón Referencia Hillmen, 1995 Peffault de Latour, 2008 Nishimura, 2004 Nishimura, 2004 Pacientes 80 460 176 209 Edad mediana (años) 42 34 30 45 Supervivencia mediana (años) 10 22 23 25 AA previa 29% 23% 38% Trombosis 39% 31% 32% 4% Transformación a leucemia/SMD 0% 8% 7%

HPN Historia Natural Amplio espectro de manifestaciones clínicas Mediana de edad al diagnóstico  40 años Mortalidad atribuible  50% (trombosis y citopenias) La trombosis es la principal causa de mortalidad y de morbilidad Mediana de supervivencia: 10-25 años Remisión espontánea: 15%

HPN Clínica Hemoglobinuria Trombosis Anemia aplásica Hemólisis intravascular– síntomas 1 dolor abdominal disfagia disfunción eréctil letargia Trombosis2,3 - hepática, cerebral  50% de pacientes Insuficiencia medular puede preceder a la HPN4,5 1. Rother et al. JAMA 2005;293:1653-627. 2. Hillmen P, Lewis SM, Bessler M et al. N Engl J Med 1995;333:1253-8. 3. Socie G, Mary JY, Gramont A et al. Lancet 1996;348:573-7. 4. Wang et al. Blood 2002;100:3897–902. 5. Dunn et al. Ann Int Med 1999;131:401–8. 12

HPN Clasificación HPN clásica: hemólisis intravascular, % elevado de granulocitos deficientes en proteínas GPI y una población mayoritaria de hematíes tipo III. Sin otra enfermedad medular asociada HPN asociada a otras hemopatías: hemólisis intravascular en el contexto de otra enfermedad medular como AA y SMD HPN subclínica: sin evidencia clínica ni analítica de hemólisis. Mediante citometría de flujo se detectan pequeños clones de células de HPN. Asociación frecuente con insuficiencia medular (AA y SMD) Parker C et al. Blood 2005;106:3699-709

¿HPN sintomática o molecular? Mosaicismo: células progenitoras normales y patológicas Enfermos con pequeños clones raramente tendrán síntomas relacionados con la HPN En pacientes con clones de granulocitos HPN < 10% la clínica de hemólisis será mínima o nula (AA y anemia refractaria) Un clon de granulocitos HPN superior a 50%: mayor riesgo de trombosis El tamaño del clon puede variar con el tiempo y un 15% de enfermos con HPN hemolítica pueden tener remisión espontánea El tratamiento va a depender, en gran medida, de la presentación clínica y del tamaño del clon HPN

HPN Tratamiento Sintomático (transfusiones, anticoagulación oral, corticoides, ácido fólico, hierro,…) Trasplante de progenitores hematopoyéticos: único tratamiento curativo Eculizumab (anti-C5): nuevo tratamiento específico de la HPN (Registro Internacional de HPN)

Eculizumab: Anticuerpo anti-C5 Human framework regions CH1 Hinge CL Complementarity determining regions (murine origin) CH2 Human IgG4 heavy chain constant regions 2 and 3 Human IgG2 heavy chain constant region 1 and hinge CH3 Rother et al. Nature Biotech 2007;25:1265–73 16

HPN Cascada del Complemento Eculizumab Vía alternativa Complejo de ataque a la membrana CD59 Vía clásica CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

HPN ¿Quién debería ser estudiado? Hemoglobinuria Hemólisis intravascular no inmune (Coombs negativo, LDH elevada) especialmente si ferropenia Trombosis de localización infrecuente: síndrome de Budd-Chiari, venas abdominales, cerebrales o dérmicas Anemia aplásica SMD: Anemia refractaria Disfagia o dolor abdominal y hemólisis intravascular Citopenias mantenidas de origen desconocido Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

HPN Evaluación inicial Estimar el grado de hemólisis: hemograma, reticulocitos, LDH sérica, bilirrubina fraccionada y haptoglobina Determinar el grado de insuficiencia medular: aspirado y biopsia de médula ósea y citogenética Establecer el déficit de proteínas asociadas a GPI: detección de poblaciones de células de sangre periférica (hematíes, neutrófilos y monocitos) deficientes en antígenos asociados a grupos GPI Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

HPN Métodos Diagnósticos Pruebas clásicas: aumento de la sensibilidad de los hematíes a la lisis mediada por el complemento Citometría de flujo (CMF): ausencia de proteínas asociadas a grupos GPI Análisis molecular: secuenciación e identificación de mutaciones del gen PIG-A

HPN Pruebas Clásicas Pruebas de Ham-Dacie y de sacarosa Técnicas laboriosas Difícil estandarización Restringidas a hematíes Falsos negativos (especialmente en pacientes transfundidos) Requiere un 5% de células tipo III (déficit total) o un 20% de tipo II (déficit parcial) para dar resultados positivos Interés histórico

Suero fresco acidificado inactivado por calor Suero fresco acidificado + magnesio Suero fresco Suero fresco acidificado Salino + hematíes Control de sacarosa Sacarosa PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

HPN Análisis Molecular Secuenciación del gen PIG-A No aplicable como técnica de rutina Laboratorios de investigación

HPN Citometría de Flujo Nicholson-Weller, 1985: aplicación de la CMF al diagnóstico de la HPN Van der Schoot, 1990: superioridad de la CMF sobre la prueba de Ham Hall & Rose, 1996: CMF como método de elección Brodsky, 1999, 2000: método diagnóstico alternativo, proaerolisina conjugada con fluoresceína (FLAER, de fluorescein-labelled AERolysin) Vidriales M. B. Haematologica (ed. esp.) 2008; 93 (Supl.2); 9-11

Citometría de Flujo Ventajas Rapidez (1 hora) Sensibilidad (clones <1%) Marcaje múltiparamétrico: con tres anticuerpos la sensibilidad puede llegar a 0,01% Análisis de diferentes líneas celulares Detección de clones de hematíes tipo I/II/III Cuantificación y monitorización del tamaño del clon HPN

HPN Citometría de Flujo El análisis por citometría de flujo es el método de elección para el diagnóstico y seguimiento de la HPN

Citometría de Flujo Células Analizar un mínimo de dos líneas celulares: Hematíes Neutrófilos y monocitos Linfocitos: discrepancias en el tamaño clonal respecto a los neutrófilos Plaquetas: expresión débil y variable de proteínas GPI en controles sanos

Citometría de Flujo Tamaño del clon HPN Tamaño del clon de hematíes - Tipos de hematíes: I/II/III - Proporción de hematíes HPN en relación a la última transfusión Tamaño del clon de neutrófilos: refleja mejor el tamaño del clon HPN Tamaño del clon de monocitos: valida el tamaño del clon HPN (puede tener discrepancias con los neutrófilos)

Citometría de Flujo Estudio de hematíes Análisis multiparamétrico con marcaje directo Adquisición con SSC/FSC en escala logarítmica Estudio de dos antígenos GPI diferentes: CD55 y CD59 (permite descartar deficiencias congénitas aisladas) Incluir un AcMo frente a un antígeno eritroide no asociado a GPI para seleccionar los hematíes (CD235a) CD59: discrimina hematíes tipo I, II y III Las transfusiones afectan el tamaño del clon de hematíes (realizar estudio tras un mínimo de un mes desde la última transfusión) El estudio puede realizarse hasta 2 semanas tras la extracción de la muestra (mantener los hematíes a 4º C) Incubación mínima de 15 min y un solo lavado Incluir un control de sangre normal

Hematíes: análisis multiparamétrico Combinación CD59 FITC/CD55PE/CD235a PE-Cy5 Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

CD59: Identificación y cuantificación de clones HPN PNH Count CD59 FITC-A Tipo I: células con expresión normal de CD59 Tipo II: células con deficiencia parcial de CD59 Tipo III: células con deficiencia completa de CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

HPN clásica: hematíes Control Control HPN clásica HPN clásica Tipo III

HPN CD59: hematíes <1% HPN subclínica HPN AA 12,2% Tipo II 84% Control HPN clásica Tipo I Tipo III

Citometría de Flujo Estudio de leucocitos El análisis en granulocitos es superior al de hematíes para establecer el tamaño del clon HPN El estudio debe ser multiparamétrico lo que permite detectar de forma simultánea la deficiencia de antígenos GPI e identificar clones de HPN de pequeño tamaño Es muy importante la selección de los AcMo contra antígenos GPI (alta expresión en células normales, específicos de una línea celular, baja afinidad por uniones inespecíficas y combinables en un marcaje múltiple) Es recomendable utilizar AcMo no asociados a GPI para seleccionar la población diana La técnica de FLAER permite detectar pequeños clones HPN

Citometría de Flujo Neutrófilos y monocitos Sangre periférica en EDTA (<24 horas) Análisis multiparamétrico con marcaje directo Neutrófilos: CD16, CD24, CD55, CD59 y CD66b Monocitos: CD14, CD52, CD55, CD59 Selección de la población: CD15, CD33 Se debe valorar la presencia de formas inmaduras y displasia (citología/CMF). Adquisición de 100.000 eventos Incluir un control normal de forma paralela CD55 y CD59: lisar y marcar Análisis inicial de neutrófilos y monocitos (CD16/CD14), si compatible con HPN analizar hematíes

Estrategia de análisis: neutrófilos y monocitos P1+P3 = granulocitos P2+P4 = monocitos Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

Neutrófilos: CD16 Control HPN Subclínica HPN Clásica

Neutrófilos: CD55 HPN AA 3,5% Control HPN clásica: 92%

Neutrófilos: CD55 HPN subclínica: 1,2% HPN AA: 6,5% HPN clásica: 92% Control

Monocitos: CD14 HPN AA: 7% Control HPN clásica: 93%

Monocitos: CD55 HPN AA: 6% HPN clásica: 93% Control

Citometría de Flujo FLAER La aerolisina es una toxina secretada por la Aeromonas hydrophila, que produce hemólisis mediante la unión a la molécula GPI La proaerosilina es una variante inactiva de la proteína bacteriana que está conjugada con fluoresceína (FLAER) y que mantiene la capacidad de unión a GPI sin causar lisis Restringida a leucocitos, permite la identificación y cuantificación de pequeños clones de HPN (<0,02%) Puede utilizarse sola o en combinación con más anticuerpos dirigidos frente antígenos GPI Permite el análisis de pacientes con SMD Brodsky RA, et al. Blood 1999; 93: 1749-1756. Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

Citometría de Flujo FLAER FLAER Alexa 488 Células normales Células normales Células HPN Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

FLAER: análisis de los clones HPN HPN Clon de granulocitos HPN = 8,9% Clon de monocitos HPN = 8,1% FLAER/ CD24 /CD16 /CD33/CD15/CD14 Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298 HPN CMF: Seguimiento El seguimiento y la monitorización del clon de HPN es esencial en el manejo clínico del enfermo En los enfermos en tratamiento con eculizumab aumenta el clon de hematíes y se iguala al de neutrófilos en unos 6 meses de media Monitorizar el clon de granulocítos es importante por el riesgo de trombosis En HPN subclínica se recomienda controlar el tamaño del clon tras iniciar tratamiento con inmunosupresores El tamaño del clon puede variar con el tiempo y pacientes con un clon de HPN estable y de tamaño intermedio peden tener una remisión espontánea Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

Citometría de Flujo Seguimiento del clon HPN Controles mínimos (Registro Internacional de HPN): Pacientes con HPN clásica sin eculizumab y en HPN asociada o subclínica: anual Enfermos con HPN con eculizumab: al inicio del tratamiento, a los 6 meses y después anual Reevaluación si cambios clínicos Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

Seguimiento Clon de hematíes con eculizumab HPN clásica: 60% diagnóstico Células control HPN clásica: 95% 1 año con eculizumab

Seguimiento Clon de neutrófilos con eculizumab HPN clásica: 94%, diagnóstico Células control HPN clásica: 98%, 1 año con eculizumab

HPN CMF: Temas pendientes El Registro Internacional de HPN requiere que los datos aportados sean lo más homogéneos posible El uso de diferentes técnicas complica la estandarización de los resultados No se dispone de criterios inmunofenotípicos validados para el diagnóstico de HPN Falta de consenso en la estrategia de análisis y en la selección de los anticuerpos Necesidad de reuniones de consenso

Citometría de Flujo Reunión de Consenso Objetivo principal: intentar llegar a un consenso en los puntos esenciales del diagnóstico de HPN por CMF, para tratar de disminuir, en lo posible, las diferencias técnicas e intentar homogeneizar los resultados entre distintos laboratorios Madrid, 27 de enero 2009

Citometria de Flujo: Reunión de Consenso Deben analizarse al menos dos líneas celulares con al menos dos antígenos asociados a GPI Marcaje multiparamétrico Se recomienda el estudio de neutrófilos y hematíes Cálculo del tamaño del clon Granulocitos: CD16, CD66, CD24 o CD55 Hematíes: CD59 o CD55/CD59 en marcaje combinado Monocitos: CD14 y CD55 En el estudio de HPN subclínica, se recomiendan técnicas de CMF de alta resolución y llegar a una sensibilidad de 0,1% Realizar el estudio de hematíes y leucocitos de forma independiente Necesidad de disponer de un control de calidad externo Madrid, 27 de enero 2009

Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de febrero de 2009 La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe