Pacientes No Infectados ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE WESTERN BLOT EMPLEADA PARA LA CONFIRMACIÓN DE CASOS CON SOSPECHA DE INFECCION POR Trypanosoma cruzi. María Isabel Jercic1, Roberto Flores2, Eugenio Ramírez 3, Víctor Muñoz 4. 1Sección Parasitología, Instituto de Salud Pública de Chile, 2 Escuela de Tecnología Médica, U. De Chile. 3 Departamento Laboratorios de Salud, Instituto de Salud Pública, 4 Programa de Parasitología, Facultad de Medicina, U. de Chile. majercic@ispch.cl. INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas en una infección causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. En el hombre esta infección puede ser congénita o adquirida y afecta principalmente el corazón y tubo digestivo. En Chile es una de las enfermedades de mayor importancia médico sanitaria, existiendo en forma endémica desde la I a la VI regiones. OBJETIVO Implementar la técnica Western blot (WB) para la detección de anticuerpos contra antígenos de T. cruzi., con el fin de mejorar la eficiencia del diagnóstico serológico confirmatorio de la infección por este parásito. MATERIAL Y MÉTODO SUEROS Se estudiaron 269 muestras, de las cuales 110 pertenecieron a pacientes con la infección confirmada serológicamente, 12 de ellas con la presencia del parásito circulante demostrada por métodos de biología molecular, 100 muestras de donantes de sangre seronegativos, 37 muestras de pacientes con otras parasitosis y 22 muestras de pacientes con patologías no parasitarias. ANTÍGENO Se utilizó un extracto soluble de antígeno procesado a partir de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, cepa Tulahuén. RESULTADOS Mediante la técnica se detectaron inmunoglobulinas A/G/M, observándose 19 bandas antigénicas específicas. Las bandas de 45, 44, y 32 kD mostraron poseer una mayor especificidad y sensibilidad, encontrándose en el 100% de las muestras positivas. El WB tuvo una sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo y una concordancia del 100%. Figura 1. Western blot de muestras de pacientes con infección por T. cruzi. Marcadores de peso molecular estándar (tira 1), suero control positivo (tira 2), suero control negativo (tira 3) y blanco reactivo (tira 4). Gráfico 1. Frecuencia de bandas detectadas por WB en las muestras de pacientes infectados con T. cruzi. kD 118  81  20,7  7,1  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Figura 2. Western blot con sueros de donantes de sangre. Marcadores de peso molecular estándar (tira 1), suero control positivo (tira 2), suero control negativo (tira 3) y blanco reactivo (tira 4). Gráfico 2. Frecuencia de anticuerpos en donantes de sangre que reconocieron por WB los polipéptidos de T. cruzi. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Figura 3. Western blot con sueros de pacientes infectados con otras parasitosis. Marcadores de peso molecular estándar (tira 1), suero control positivo (tira 2), suero control negativo (tira 3) y blanco reactivo (tira 4), paciente con Leshmania (tira 6), paciente con Crysptosporidiosis (tira 7). Gráfico 3. Frecuencia de reacción con polipéptidos de T. cruzi de anticuerpos presentes en sueros de pacientes diagnosticados con otras parasitosis. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tabla 1. Tabla de resultados utilizada para el cálculo de sensibilidad y especificidad del WB Pacientes Infectados Pacientes No Infectados TOTAL Resuultados WB Positivos 110 Resultados WB Negativos 159 269 Separación electroforética y obtención de las fracciones del antígeno de T. cruzi. A, Migración electroforética del marcador de peso molecular estándar (carril derecho) y de las proteínas de T. cruzi (carril izquierdo). B, Remanente de las proteínas del parásito en el gel después de la transferencia. CONCLUSIONES La técnica presentó un 100 % de sensibilidad, especificidad y concordancia al realizar el análisis estadísticos con los resultados de los sueros estudiados. Los valores predictivos positivos y negativos fueron del 100 %. De acuerdo a estos resultados se puede concluir que el uso de esta técnica, como parte del algoritmo de confirmación de muestras con tamizaje positivo, mejorará el diagnóstico serológico de la infección por Trypanosoma cruzi en Chile. 207  118  81  52,5  29,9  20,7  7,1  kD A B