ESTANDARIZACIÓN DEL METODO DE ELISA – Ig E ESPECÍFICA, PARA DETECTAR ANTICUERPOS CONTRA Echinococcus granulosus UTILIZANDO UN ANTÍGENO PURIFICADO. Standardization.

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1 ESTANDARIZACIÓN DEL METODO DE ELISA – Ig E ESPECÍFICA, PARA DETECTAR ANTICUERPOS CONTRA Echinococcus granulosus UTILIZANDO UN ANTÍGENO PURIFICADO. Standardization of specific inmunoglobulin E ELISA assay by using purified antigen in human hydatid disease. María Isabel Jercic 1, Ximena Lazcano 2, Víctor Muñoz3. 1 Sección Parasitología, Instituto de Salud Pública de Chile, 2 Escuela de Tecnología Médica, U. De Chile, 3 Programa de Parasitología, Facultad de Medicina, U. de Chile. INTRODUCCIÓN La hidatidosis humana es la infección de animales herbívoros o del hombre con la forma larval o metacestodo de Echinococcus granulosus. En Chile es uno de los problemas importantes en salud pública por el número de afectados y las pérdidas económicas que implica el tratamiento de esta parasitosis. Con le objetivo de contar con una técnica para el seguimiento posterior al tratamiento de pacientes con esta patología, se estandarizó la técnica de ELISA, para la detección de inmunoglobulina IgE específica contra Echinococcus granulosus, utilizando diferentes preparaciones de antígeno (Ag) obtenidas mediante un proceso de purificación. OBJETIVOS Estandarizar el método de ELISA, para la detección de inmunoglobulina IgE específica circulante contra antígenos del estado larval de Echinococcus granulosus, en pacientes con hidatidosis comprobada quirúrgicamente. Purificar antígenos obtenidos a partir de liquido hidatídico de origen ovino, a través del método descrito por Oriol y col (1971), y modificado por Rogan y col (1991). Evaluar la sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo y negativo de la técnica ELISA-IgE especifica utilizando sueros de pacientes con hidatidosis comprobada quirúrgicamente, sueros de donantes de sangre provenientes de zonas de baja endemia, pacientes con patologías no parasitarias, y pacientes con otras parasitosis. MATERIAL y MÉTODO SUEROS: Se estudiaron 200 muestras de sueros obtenidas a través de la Red Nacional de Laboratorios, en el Instituto de Salud Pública de Chile (ISP). Sueros positivos: 80 sueros de pacientes con hidatidosis confirmada quirúrgicamente. Sueros negativos: 70 muestras de suero de donantes de sangre provenientes de zonas de baja endemia. Sueros de pacientes con otras parasitosis: Cisticercosis 2 , Fascioliasis 4, Toxocariasis 6, Triquinosis 2, Toxoplasmosis 9, Enf. De Chagas 4, Strongiloidiasis 3, Taeniasis 6. Sueros de pacientes con enfermedades no parasitarias: Eosinofilia 6, Sífilis 5, Enf. autoinmunes 3. ANTÍGENO: Se obtuvo a partir de líquido hidatídico de origen ovino, el cual fue dializado contra agua destilada, liofilizado y almacenado a 4°C, según el método descrito por Varela Díaz y Coltorti (1974). Se prepararon 2 fracciones antigénicas: una rica en antígeno 5 y B, y otra rica en antígeno B, a partir de líquido hidatídico, utilizando el método de precipitación a baja fuerza iónica (buffer acetato pH5, 0.005M) descrito por Oriol y col. (1971), modificado por Rogan y col. (1991). RESULTADOS La sensibilidad y especificidad del método fue de: 81,3% y 32,9% cuando se usó extracto crudo de líquido hidatídico total (LHT); 91,3% y 82,9% cuando se utilizó la fracción rica en Ag 5 y B; y 75,0% y 87,7% cuando se usó la fracción de Ag B. El valor predictivo positivo y negativo fue de: 58,0% y 60,0% con extracto crudo; 85,9% y 89,2% con Ag. 5/B; y 86,95% y 75,3% con Ag B. La técnica presentó un nivel de concordancia de 58,3% con extracto crudo, el cual mejoró al utilizar Ag 5/B (87,3%) o Ag B (80,7%) respectivamente. Se observaron reacciones cruzadas con otras patologías y con otras parasitosis, cuando se utilizó extracto crudo como antígeno, las cuales disminuyeron cuando se utilizaron las fracciones purificadas. Figura 1: Electroforesis en SDS – PAGE 15% de las fracciones proteicas obtenidas durante el proceso de purificación de antígenos hidatídicos Figura 2 Placa de ELISA IgE sensiblizada con la fracción 5-B, sueros positivos y negativos. A B C D E F G H I Kda  207  118  81  52,5  36,2  29,9 20,7  7,1 Fig. 1: Análisis en SDS – PAGE 15% de las muestras de líquido hidatídico durante el proceso de purificación de antígenos. A) Líquido hidatídico total (LHT). B) Precipitado posterior a la diálisis con tampón acetato. C) Sobrenadante posterior a la diálisis con tampón acetato D) Precipitado posterior a la saturación con sulfato de amonio E) Precipitado posterior a la ebullición F) Sobrenadante posterior a la saturación con sulfato de amonio G) sobrenadante posterior a la ebullición. PM: marcador de peso molecular Gráfico 1: Densidades ópticas de las muestras analizadas mediante ELISA IgE utilizando la fracción 5-B como antígeno Tabla 1: Resultados de sensibilidad , especificidad y valores predictivos de la técnica ELISA Ig E obtenidos con las distintas fracciones proteicas empleadas Preparación antigénica Criterio Extracto crudo de LHT Ag. 5/B Ag. B Sensibilidad 81,3 (70,64 – 88,78)* 91,3 (82,25 – 96,11) 75,0 (63,84 – 83,71) Especificidad 32,9 (22,37 – 45,23) 82,9 (71,57 – 90,45) 87,71 (76,49 – 93,59) Valor Predictivo Positivo 58,0 85,9 86,95 Valor Predictivo Negativo 60,5 89,2 75,3 CONCLUSIONES De acuerdo a los cálculos estadísticos, la técnica ELSA – IgE presentó una sensibilidad y especificidad de 91,3% y 82,9% cuando se utilizó Ag. 5/B y de 75,0% y 87,7% cuando se usó Ag. B, ambos parámetros fueron muy superiores a los obtenidos con el extracto crudo. Lo mismo ocurrió con el valor predictivo positivo y negativo: 58,0% y 60,0% con extracto crudo, 85,9% y 89,2% con Ag. 5/B, 86,95% y 75,3% con Ag. B. Se confirma la importancia de usar antígenos purificados en la técnica de ELISA, especialmente en la determinación de IgE específica. Además, se puede decir que la prueba tiene mejor rendimiento cuando se utiliza la fracción rica en antígenos 5 y B. Por lo anterior, se puede afirmar que la técnica de ELISA – IgE utilizando Ag. 5/B presenta una sensibilidad y especificidad que permitirían utilizarla en el estudio de la respuesta inmune de los pacientes con hidatidosis. Se propone realizar un estudio para evaluar la utilidad de esta técnica en el seguimiento post tratamiento quirúrgico o farmacológico de pacientes con hidatidosis, además, de incorporar el estudio de IgE total, ya que la determinación de IgG no sería adecuada para realizar un seguimiento serológico de esta parasitosis.