UNIDAD 2 : ENZIMAS, CINETICA Y REGULACION. Bqf. Willan Antonio Muñoz-Chamba Magister Biotecnología Molecular UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS ESCUELA DE MEDICINA

Reacciones químicas – metabolismo. Proteínas - ribozimas Reacciones químicas – metabolismo. Diagnosticar enfermedades, predecir pronostico. Actividad enzimática. Genéticos, nutricionales Actividad Catalítica, especificidad de sustrato, estereoespecificidad Industria química, alimenticia ENZIMAS

Reacción Química Un ser vivo miles de reacciones constantemente METABOLISM O En el organismo 0,1 s Fuera del organismo 10 min Velocidad rx Algo que afecte DEPEND E [S] Tº CATALIZAD OR Vel. rx No participa en la reacción Concepto de Enzima BIOCATALIZADOR Concepto de Enzima BIOCATALIZADOR Activa en reacciones bioquímicas. Altamente especifica. Naturaleza proteica. Ribosima s

 Clasificación de las enzimas.  Aun se utiliza nomenclatura tradicional. Pepsina, tripsina, amilasa.  Algunos añadieron termino asa  Deshidrogenasas, proteasas, isomerasas.  Luego el nombre del sustrato que actúan  xantina oxidasa,  Su fuente  ribonucleasa pancreática  Modo de regulación  lipasa sensible a hormona  Dato característico  cisteína proteasa  Números y letras detectar diversas formas de enzimas  RNA pol III

INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTS HEXOCINASA  ATP:D hexosa-fosfotransferasa E.C miembro de la clase 2 (transferasas), subclase 7 (transferencia de un grupo fosforilo), subclase 1 (el alcohol es aceptor de fosforilo, hexosa 6 el carbon fosforilado es el 6.

Estructura de las Enzimas Proteicas Apoenzima Cofactor Coenzimas GRUPO PROSTETICO Sitio de Fijación. Sitio Catalítico Centro activo

Con el afán de entender qué son las enzimas, cuál es su función y su importancia, es necesario establecer la definición de los siguientes conceptos: Catalizador Enzima Ribozima Cofactor Coenzima Grupo prostético

Conocemos como catalizador a cualquier sustancia que acelera la velocidad de una reacción, pero sin participar químicamente en ella. Por ejemplo, la descomposición del peróxido de hidrógeno a agua y oxígeno es extremadamente lenta, pero la adición de ión férrico acelera la reacción, con la formación observable de burbujas de oxígeno. Reacción del peróxido de hidrógeno con la sangre

Las reacciones de los sistemas biológicos suceden en tiempos apreciables debido a que están catalizadas por agentes, en su gran mayoría de naturaleza proteica, llamados enzimas. Por lo que podemos concluir que las enzimas son los catalizadores de los sistemas biológicos. Modelo de tridimensional de cintas de una enzima

Una ribozima es una enzima de naturaleza ribonucleica, es decir, está formada por una o varias cadenas de ARN. Son necesarias para la expresión correcta de los genes. Por ejemplo, tenemos a los RNA nucleares pequeños (U1 a U6) Intrón autoeditable de Tetrahymena

Cofactores se asocian de manera reversible con enzimas o sustratos. Unen de manera transitoria, disociable. Debe haber cofactores en el medio que rodea a la enzima. La DNA polimerasa, enzima encargada de la replicación del DNA, necesita de Mg +2 para su actividad. DNA polimerasa Cofactores mas comunes iones metálicos

Una coenzima es una molécula que sirve como transbordador de sustrato. (FADH estabilizan especies como átomos de hidrogeno, NADH iones híbridos). Reconocimiento y unión de grupos químicos pequeños coenzima A (acetato) UDP. Reacción de óxido- reducción de la niacina (vitamina B 3 ) COLABORAN EN EL PROCESO APORTANDO CON ENERGUA ATP O ELECTRONES NAH

Un grupo prostético es una molécula con características químicas diferentes a la enzima (como una coenzima), que está unida a ella, pero que no participa como parte del sitio activo. Por ejemplo, algunas enzimas están glucosiladas o tienen residuos de lípidos. Hem. Iones metalicos: Fe, Co, Cu, Mg, Mn, Zn La inmunoglobulina G tiene residuos de carbohidrato en la región constante Derivados de la vitamina B12 hidrosoluble. Nicotinamida  NAD, NADP Riboflavina  FMN, FAD Acido pantoténico  acarreador grupo acilo, coenzima A Tiamina  descarboxilación a-cetoácidos. Acido fólico y cobamida  metabolismo de un carbono.

ENZIMAS BIOCATALIZADORES Como Actúan Enzimas rebajan Energía de Activación Unión de enzima a S debilitando enlaces internos Atrayendo los reactivos probabilidad de encuentro. características No se alteran no son S ni P Altamente especificas Acción optima Acción reguladora COMPLEJO E- S Catálisis por proximidad. Catálisis acido básica. Catálisis por tensión. Catálisis Covalente Emil Fischer principios siglo xx Sitio de Fijación. Sitio Catalítico Centro activo

MODOS DE ACCION ENZIMATICA Como se forma? Modelo Llave- Cerradura Fisher 1893 Explica una alta especificidad. Cambia sitio activo, afecta eficacia de la enzima. Problema Catálisis enzimática Sitio Activo Rigido

Modelo de Ajuste inducido Daniel Koshland (1958) Sitio Activo flexible. Produce Ajuste. Cambio de conformación del centro activo. Ajuste perfecto. Mejor catálisis

Mecanismos para facilitar la catálisis. Catálisis por proximidad  sustratos orientados en proximidad a enlace, con alta concentración de sustrato Catálisis acido básica  especifica para acido o para base, grupos laterales de aminoácidos Catálisis por tensión  cambio conformacional que tensa enlace covalente y lo hace mas débil, reacciones líticas. Intermediario de estado de transición Catálisis covalente  reacciones de transferencia de grupo cambio conformacional enzima enlace covalente. Cisteína, serina, histidina

Catálisis acido básica  Proteasa del VIH Catálisis covalente  fructosa 2-6 bifosfatasa

Sustratos inducen cambios conformacionales en las enzimas.  Modelo de Koshlan.  Isozimas son formas de enzima distintas que catalizan la misma reacción.  La actividad catalítica de enzima facilita su detección.  enzimología de molécula única.  Fármacos inhibidores de enzimas  investigación de alta capacidad de procesamiento HTS (cribado de alto rendimiento).  Inmunoanalisis ligados a enzimas  ELISA análisis inmunosorbente ligado a enzima

Inmunoensayos ligados a enzima Anticuerpos enlazados a “enzimas reporteras” (fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante) Fluorescencia o absorción de luz. Placa de microtitulaciónmuestras Proteínas quedan inmovilizadas

Enzimas para el diagnostico clínico.  Plasma sanguíneo  determinación de procesos morbosos.  Análisis cuantitativo de enzimas(plasma, suero, orina, células): diagnostico, pronostico y respuesta al tratamiento Pseudocolinesterasa, lipoproteína lipasa. Cascada de eventos de coagulación. Disolución del coagulo Añaden a sangre después de muerte o daño celular. Diagnostico y pronostico de enfermedades.

 No son especificas para la enfermedad deseada.  Examen clínico integral.  Edad del paciente, sexo, antecedentes personales patológicos y no patológicos, consumo de fármacos o drogas, sensibilidad y especificidad diagnostica de la prueba enzimática.

Enzimas en infarto de miocardio  Enzima especifica para tejido u órgano.  Detección de enzima rápida  > 12 horas utilidad limitada.  Aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y lactato deshidrogenasa (LDH). Aparecen con lentitud.  Lactato deshidrogenas dos tipos de monómeros  H y M combinan y dan 5 izosimas: HHHH (I1), HHHM (I2), HHMM (I3), HMMM (I4) y MMMM (I5).

 Creatinina cinasa (CK)  CKMM (músculo estriado), CKBB (cerebro) y CKMB (corazón y músculo estriado).  Aparece 4 – 6 H. luego de MI.  Medición de concentración plasmática de CK  trastornos del musculo esquelético (Distrofia muscular de Duchene).

Troponinas  Complejo de tres proteínas comprendidas en la contracción muscular musculo estriado y cardiaco. Troponinas cardiacas I y T  2 – 6 H después del infarto, permanecen durante 4 a 10 días.  Marcador de todo daño del musculo cardiaco.

Usos clínicos adicionales de las enzimas.  Glucosa oxidasa  concentración plasmática de glucosa.  Activador de plasminógeno hístico (tPA) estreptocinasa  tratamiento de IM agudo.  Tripsina  tratamiento de fibrosis quística.  Infusión intravenosas de glucosilasas (recombinantes)  síndromes de almacenamiento lisosómico. Gaucher, Pompe, Enfermedad de Fabry, Sly

Enzimas en el diagnostico de enfermedades genéticas e infecciosas.  Endonucleasas de restricción  reconocen sitios de restricción. RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción).  Rasgo de células falciformes, talasemia β, fenilcetonuria en lactantes y enfermedad de Huntington.  Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)  Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas, y Neisseria meningitidis, el agente causal de la meningitis bacteriana, por medio de la amplificación selectiva de su DNA.

DNA recombinante para el estudio de enzimas.  Estudio de estructura y función  grandes cantidades y purificación.  Clonación de genes  E. coli, levaduras  bioreactores  Grandes proteínas  modificaciones postraduccionales.  sistema de cultivo de células, vector de expresión de baculovirus de células de insecto cultivadas.  Purificación afinidad cromatográfica. Proteínas de fusión de glutatión.  Mutagénesis dirigida.

FACTORES QUE AFECTAN LA ACCION ENZIMATICA 1. CONCENTRACION DE SUSTRATO S Vel. rx Mas sustancia a esa enzima Para una misma concentración de enzima Vel. Max. No vel. Rx. Por que? Saturación enzimática. Todas las enzimas formando complejo E-S Constante de Michaelis-Menten. Concentración de sustancia a la cual la velo. De la rx es a la mitad. Indicador de la afinidad enzimática. Km aum. De la actividad enzimática

TEMPERATURA Curva sesgada a la derecha T. optima Excesiva movilidad molecular Desnaturalizaci ón

pH Curva simétrica Disminución de radicales ácidos ionizables Disminución de radicales básicos ionizables

REGULACION ENZIMATICA ORGANISM O Condiciones Cambian Requiere Flexibilida d metabólica REGULACION ENZIMATICA 1, ACTIVACION Sust. Que van activar enzimas Zimógenos Enzimas digestivas. Activan sitio. Enzimas de la coagulación Principio de máxima economía celular

2INHIBICION Sustancias inhibidoras Irreversibles reversibles (envenenamiento). Fijación covalente fuerte al centro activo No competitiva Competitiva Sustancias impiden unión del sustrato Inhibidor igual al sustrato

3Enzimas Alostericas

MODULADORE S POSITIVOS Y NEGATIVOS