INMUNOANALISIS Servicio Medico Legal Santiago Q. L. Ethel Guerrero R. Q. F. L. Víctor Vidal P.

Definición   Técnicas que utilizan la reacción antígeno- anticuerpo para el análisis cualitativo y cuantitativo de diversas sustancias.   En general se utiliza un anticuerpo como reactivo para detectar o cuantificar lo que nos interesa, el antígeno.   Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales

Producción de Anticuerpos   Requiere la inyección de varias dosis del antígeno o hapteno unido a molécula transportadora inmunógena de Peso Molecular elevado, a un animal (conejo, cabra, oveja, caballo) a intervalos regulares, para posteriormente sacrificar el animal y obtener el antisuero.

Anticuerpos Policlonales Separar el suero Purificación de anticuerpos

Anticuerpos Monoclonales  ganglios  Se obtienen de manera similar, pero se extrae el bazo o ganglios linfáticos para obtener linfocitos B sensibilizados.   Se incuban estos con células de mieloma de ratón deficitarias de la enzima HGPRT en presencia de PEG para producir la fusión celular y obtener el hibridoma

  Cultivados en medio apropiado, por dos semanas, solo crecen los hibridomas, que producen diferentes tipos de Ac. específicos contra el antígeno.   Por dilución se aislan los diferentes hibridomas, obteniéndose los clones adecuados, los cuales se cultivan, para producir el Ac. Monoclonal más adecuado.

Anticuerpos Monoclonales Linfocitos sensibilizados Células de Mieloma Hibridomas Fusión

Anticuerpos Monoclonales Cultivo de células individuales en pequeño volumen Producción de Ac - + Crecimiento continuo

Anticuerpos Monoclonales Cultivo en grandes volúmenes Recuperar y purificar el AcMo secretado

Anticuerpos Monoclonales  Ventajas con respecto a los policlonales: –Alta especificidad, reconocen un único lugar antigénico. –Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características.  Desventajas: –Mayor costo

Ejemplos  Cualitativo o de identificación: Inmunoblot  Cuantitativo: ELISA

Inmunoanálisis con reactivos marcados  Dentro de estos inmunoanálisis tenemos: –radioinmunoanálisis –enzimoinmunoanálisis –fluoroinmunoanálisis –luminoinmunoanálisis

Inmunoanálisis con reactivos marcados –homogéneos y heterogéneos –diseño competitivo o no competitivo

Según el diseño del ensayo competitivos (d e reactivo limitado) no competitivos (d e reactivo en exceso)

Competitivos  Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antígeno o anticuerpo.  Una cantidad limitada de anticuerpos que es insuficiente para unir todo el antígeno.  El antígeno marcado compite con el antígeno sin marcar por los anticuerpos. La cantidad de analito se determina a partir de la regresión correspondiente.

Competitivo- Captura de anticuerpos E Ag muestra + Ac marcado E + Ag muestra Ac marcado E Sustrato [Ag] Señal

Competitivo- Captura de Antígeno Antígeno marcado Muestra Lavado Señal [Ag] Señal

Métodos no competitivos o inmunométricos  El antígeno a cuantificar se une a un exceso de anticuerpos.  Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase sólida, revelando con anticuerpo marcado.  La concentración de antígeno se determina a partir de la cantidad de anticuerpo marcado que se une.

Ag + Exceso de anticuerpo marcado eliminado por lavado E E Sustra- to Señal [Ag] Curva standard bloqueante No competitivo- “sandwich” de anticuerpos

Según el diseño del ensayo homogéneos heterogéneos

 Heterogéneos:  Los más utilizados.  Diversos formatos : –micro placas, –partículas magnéticas, –Membranas de nitrocelulosa,  Implican un paso de separación del antígeno unido del no unido. Por ejemplo ELISA, los pasos de lavado son etapas de separación.  Homogéneos  Mas utilizados en drogas de abuso y monitoreo de fármacos  Sin pasos de separación, no se requiere la separación del antígeno unido del no unido.  Ejemplos –Emit –Cedia

 Ventajas –Menos interferencias, más específicos y sensibles –Instrumentación menos costosa –Admiten mayor tamaño de muestra, así disminuye el límite de detección. –Más versátiles en cuanto a tipo de analito  Desventajas –Más difíciles de automatizar –Mayor tiempo de análisis  Ventajas –Más precisos –Al ser en general automatizados se llevan a cabo sin entrenamiento especial  Desventajas –Son más costosos en reactivos –En general sólo sirven para fármacos HeterogéneosHomogéneos

Heterogéneos  Algunos métodos de separación: –Precipitación fraccionada con sulfato de amonio, etanol en frío o PEG. –Unión de la forma unida a una fase sólida (EIA, partículas magnéticas) –Centrifugación

Homogéneos Características  La cuantificación de la reacción Ag-Ac en los EIA homogéneos se realiza por cambios en la señal proveniente de la marca sin hacer separación física de las formas libre y unida.  El cambio de señal depende de la inhibición, activación o cambios conformacionales en la enzima.  Monitoreo terapéutico de fármacos (digoxina) detección de drogas de abuso.

Homogéneos Ag Sustrato Enzima Ac Ag

Homogéneos Enzima activaEnzima inactiva S Detección y Cuantificación: Las medidas se pueden hacer con: - un simple espectrofotómetro o con - un analizador automático de química clínica.

Inmunoanálisis con reactivos marcados Con compuestos radiactivos: –RIA inmunoanálisis heterogéneo y competitivo –IRMA inmunoanálisis heterogéneo no competitivo

Inmunoanálisis con reactivos marcados ENZIMOINMUNOANALISIS:  Las más utilizadas son: –peroxidasa –fosfatasa alcalina –Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa –B- galactosidasa  Ventajas –disponibles comercialmente –se pueden conjugar por técnicas simples –tienen varios sustratos

ENZIMOINMUNOANALISIS  Enzimoinmunoanálisis homogéneos: -EMIT -CEDIA -Enzimoinmunoanálisis heterogéneos: -ELISA

FLUOROINMUNOANALISIS  Fluoroinmunoanálisis homogéneos: -FPIA (de polarización de fluorescencia) -SLFIA (sustrato marcado) -FETI (transferencia de la energía de fluorescencia) -Fluoroinmunoanálisis heterogéneos: -DELFIA (disociación aumentada por lantánidos)

Fluoróforos Fluoresceína Inmunoensayos de Fluorescencia

Quimioluminiscencia  Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas y consiste en: –una reacción química con un muy alto rendimiento energético produce una molécula potencialmente fluorescente. –(No hay excitación luminosa como en la fluorescencia) –Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O 2 o H 2 O 2 y un sustrato orgánico oxidable. La energía se libera como luz visible.  Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de moléculas, menor límite de detección que en los métodos isotópicos y en otros enzimáticos.

Técnica analítica Quimioluminiscente  Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reacción quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la quimioluminiscencia es el paso final en la detección.  Se hacen en fase sólida, o en técnicas homogéneas