Proteasas Parasitarias

Proteasas Definición Se trata de enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptídicos (subclase E.C 3.4) Proteólisis limitada: limitado número de enlaces hidrolizables Proteólisis ilimitada: proteasoma, lisosomas

Enlace Peptídico Características Plano Rígido Polar Restringe conformación de la cadena polipeptídica

El Problema Químico

Proteasas Nomenclatura

Proteasas Nomenclatura de Schercher y Berger

Proteasas Clasificación según mecanismo de acción Serina proteasas Cisteína proteasas Metaloproteasas Aspártico proteasas Treonina proteasas Glutámico proteasas

Proteasas Clasificación Familia: homología significativa a nivel de secuencia de amino ácidos en la porción catalítica. Clan: Grupos de familias que han evolucionado a partir de una proteína ancestral. Similitud a nivel de estructura tridimensional

Proteasas en los Genomas Eucariotas

Serina proteasas Generalidades Familia de Qumiotripsina: Tripsina, elastasa, factores de la coagulación XIIa, XIa, IXa, plasmina Familia Subtilisina, enzimas bacterianas Tríada catalítica

Serina Proteasas Mecanismo de Acción Catalítica Tríada Catalítica: His57, Asp102 y Ser195 -Formación de acil intermediario entre el substrato y la Ser Formación de este intermediario covalente se produce a través de un intermediario tetrahédrico de transición cargado negativamente Se cliva el enlace peptítico

Serina Proteasas Mecanismo de Acción Catalítica (cont.) Fase de deacilación El intermediario acil-enzima se hidroliza por una molécula de agua liberado el péptido y restaurando el hidroxilo en Ser La His provee una base y acepta el OH de la Ser reactiva

Cisteína Proteasas Generalidades Papaína, catepsinas lisosomales B, H y L Calpaínas citosólicas Díada catalítica: Cis25, His159 juegan los mismos roles que Ser e His en serina proteasas

Cisteína Proteasas Mecanismo de Acción Catalítica La catálisis también se produce a través de la formación de un intermediario covalente e involucra a Cys e His El nucleófilo es en este caso un ion tiolato en lugar de un grupo hidroxilo El tiolatio se estabiliza por la formación de un par iónico con el imidazol vecino en la His El ataque nuclefílico es en este caso el par iónico tiolato-imidazol en ambos pasos, por tanto no se requiere una molécula de H2O2

Metaloproteasas Generalidades Amplias differencias en secuencias y estructura La gran mayoría contienen Zn en sitio activo Ej: Termolisina, metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs), algunas aminopeptidasas Sito activo de la termolisina mostrando Zn, HIS142, HIS146 and GLU166.

Metaloproteasas Mecanismo de Acción El mecanismo catalítico lleva a la formación de un intermediario tetrahédrico no covalente luego del ataque de la molécula de H2O unida al Zn sobre el grupo carbonilo del enlace peptídico. El intermediario se descompone por la transferencia del protón del ácido glutámico al grupo NH

Aspártico Proteasas Generalidades Ejemplos: Familia de la Pepsina:catepsina D, renina Familia de proteasas del HIV (retropepsina). Son monoméricas, por lo que la dimerización se requiere para formar la enzima activa Se trata de enzimas bilobuladas donde el sitio activo está entre dos lóbulos homólogos. Cada lóbulo contribuye con un aspartato El pH óptimo es ácido para la mayoría de las aspártico proteasas, donde un protón está compartido por los dos aspartatos del sitio activo El agua es activada por los aspartatos para realizar el ataque nucleofílico

Aspártico Proteasas Mecanismo de Acción Los 2 residuos aspartil tienen una gran proximidad geométrica en la molécula Un aspartato se ioniza mientras que el segundo no lo está al rango de pH óptimo de 2-3 La catálisis de las aspártico proteasas no involucra la gneración de un intermediario covalente si bien existe un intermediario tetrahédrico. El ataque nucleofílico se consigue por 2 transferencias simultáneas de protones: una desde el H2O2 a la díada de dos carboxilos y otra desde la diáda al oxígeno carbonilo del substrato con el consiguiente clivaje CO-NH En términos generales es una catálisis ácido-base.

Inhibidores de Proteasas Bajo Peso Molecular Cisteína: E-64, Leupeptin Serina: Di isopropilfluorofosfato (DFP), PMSF, Benzamidina, Dicloroisocumarina Metalo: EDTA, EGTA, Fenantrolina, Bestatina Aspártico: Pepstatina

Inhibidores de Proteasas Inhibidores Naturales Mas de 100 compuestos naturales identificados Desde bacterias a animales y plantas Reversibles o seudo-irreversibles Impiden acceso al sitio activo Proteicos, de 50 a 400 aa Clase específicos excepto familia de α- Macroglobulina Inhibidores de Serina y Cisteína proteasas son los mejor caracterizados. Ej. α-1 antitripsina y cistatinas

Metodología de Estudio Substratos Cromogénicos Estos substratos, al clivarse generan un compuesto cromogénico. La tasa de hidrólisis se mide en Los más utilizados son péptidos 4-nitroanilides pNA) y péptidos thioesteres

Metodología de Estudio Sustratos Fluorgénicos Generan un compuesto fluorogénico al producirse el clivaje. La tasa de hidrólisis se cuantifica por medio de un espectrofluorómetro o fluorómetro en forma continua o ensayos puntuales. Los sustratos más usados son los que tienen acoplado AMC (peptidyl 4-metil-7 cumarilamidas).

Metodología de Estudio Sustratos con Quenching intramolecular En estos substratos, la secuencia peptídica separa un grupo fluorescente dador de un grupo aceptor que actúa como mitigador (quencher) de fluorescencia. El fenómeno se llama transferencia de energía resonante. El clivaje del enlace peptídico lleva a separación del par dador-aceptor produciendo un incremento de la fluorescencia. Existen varios pares de dador-aceptor reportadoss, por ej. o-aminobenzoic acid (Abz) como dador y 2, 4 dinitrophenyl (Dnp) como aceptor.

Substratos sintéticos Ejemplos Cathepsin B Bz-Arg-pNA Pyr-Phe-Leu-pNA Z-Arg-Arg-pNA Z-Phe-Arg-pNA Z-Arg-Arg-MCA Z-Phe-Arg-MCA Cathepsin G MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Suc-Ala-Val-Pro-Phe-pNA Suc-Phe-Leu-Phe-pNA – Cathepsin H H-Arg-pNA Bz-Arg-pNA H-Arg-MCA Cathepsin L Z-Phe-Arg-pNA Z-Phe-Arg-AMC

Geles de gelatina-SDS-PAGE CL1 gelatinolytic activity CL2 29 kDa CL1 27,5 kDa CL2 gelatinolytic activity

SDS-PAGE acoplado a Substratos Fluorogénicos

Acciones de las Proteasas Parasitarias en el Contexto del Parasitismo Invasión Migración Nutrición Evasión de la respuesta inmune Inmunomodulación

Invasión y Migración Membranas Basales y Matríz Extracelular

Nutrición Hemoblobina Proteínas del suero Proteínas intracelulares Proteínas extracelulares (MEC)

Evasión de la Respuesta Inmune Degradación de Igs (IgG, IgM, IgE, IgA) Degradación de componentes del Complemento Clivaje de moléculas de superificie de células del sistema inmune (Ej. CD4)

Inmunomodulación La cisteína proteasa CPB2.8 de Leishmania mexicana induce una fuerte respuesta de tipo Th2 asociada a la progresión de la enfermedad

Enfermedad de Chagas Causada por el flagelado Trypanosoma cruzi Parásito heteroxeno 3 formas: Forma replicativa intracelular obligatoria amastigote, forma tripomastigote circulante y forma epimastigota replicativa en el insecto vector

Proteasas de Trypanosoma cruzi Cisteína proteasas Cruzipaína (cruzaína, GP57/51) Catepsina B-like proteinasas CAAX Prenyl proteasa

Proteasas de Trypanosoma cruzi Serina proteasas Oligopeptidasa B Prolil Endopeptidasa Tc80 (colagenasa) Serina carboxipeptidasa

Proteasas de Trypanosoma cruzi Metaloproteasas Genes pertenecientes a la familia gp63 de Leishmania, una metaloproteasa asociada a membrana celular han sido descritos en T. cruzi.

Cruzipaína Responsable de la actividad cisteína proteasa más promienente de T. Cruzi Se expresa en todos los estadíos parasitarios La mayoría tiene localización lisosomal, pero hay isoformas asociadas a membrana plasmática y habría alguna secretada Endoproteasa, digiere proteínas como caseína, SAP, hemoglobina y sustratos sintéticos a pH 7-9. Prefiere Arg o Lys en P1 y un hidrofóbico o con carga + en P2 (Leu>Tyr>Phe>Val)

Cruzipaína Especificidad intermediaria entre Catepsinas L y B en función de AA en P2 Inhibida por organomercuriales, E-64, leupeptin, TLCK, cistatina, stefina, chagasina y derivados peptidil fluorometanos Peptidos con secuencia YHNGAA del pro-dominio también la inhiben Z-Phe-Ala-fluorometilketona E-64

Cruzipaína Corte de subclases de IgG

Cruzipaína Corte de subclases de IgG

Cruzipaína Corte de subclases de IgG

Malaria Causada por protozoarios apicomplexa del género Plasmodium 300 millones de infectados, más de un millón de muertes anuales Ciclo complejo, transmitidos por vector invertebrado (mosquito Anopheles)

Proteasas de Plasmodium en la Digestión de la Hemoglobina Se desarrolla en la vacuola alimenticia Consume el 75% de la Hb Se producen pequeños péptidos pero no AA por lo que existirían transportadores Las Plasmepsinas I - IV son aspártico proteasas implicadas en la primera fase de la digestión Las Falcipaínas I y II son cisteína proteasas que degradan los polipéptidos grandes generados La Falcilysina, una metaloproteasa de la familia M16, degrada los pequeños péptidos Una aminopeptidasa citosólica completaría el proceso produciendo AA libres

Plasmepsinas Nutrición Degradación inicial de Hb nativa (plasmepsina I) Clivan enlace Leu203-His204 en región bisagra de cadena α

Plasmepsinas Invasión Clivaje de espectrinas (CH3) del esqueleto de la membrana plasmática del GR

Amebiasis Infección intestinal o extraintestinal causada por Entamoeba histolytica 50 millones de infectados y 110 mil muertes anuales 2 especies reconocidas Entamoeba histolytica – patógena Entamoeba dispar – comensal (10% población mundial)

Cisteina Proteasas de Entamoeba histolytica y E. dispar

Proteasas en la Patogenia de la Amebiasis

Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de CP Peptidil diazometanos basados en la secuencias LVG de las cistatinas , , epoxi ketonas - > potencia que E-64c Bis-arylacylhydrazidas y aril ureas-reversibles Mercaptoetilketonas, algunas con Ki de 1nM

Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de CP La actividad de los inhibidores de CP contra T. Cruzi en cultivos o modelos animales correlaciona con la inhibición directa de la CP. No se pueden descartar otras acciones. En su mayoría los inhibidores también actúan sobre las catepsinas de mamíferos. Las células no se ven afectadas por las concentraciones que matan los parásitos. Redundancia?. Los parásitos resistentes a los inhibidores de CP no se mostraron resistente a drogas establecidas como nifurtimox indicando mecanismos diferentes