Métodos de Detección del HIV Dr. García Carassas Jorge Luís Médico Patólogo Clínico Esp: Análisis Clínicos y Banco de Sangre Hosp. Regional Docente Las Mercedes – Chiclayo.

GENERALIDADES CUANDO APARECIÓ EL SIDA: Se había erradicado la viruela y estaban bajo el control de la peste, rabia , tifoidea, fiebre amarrilla, paludismo y dengue. Se había erradicado otras enfermedades inmunoprevenibles en otros países. Se creía que los antibióticos y químico terapéuticos era la solución mágica. La economía prosperaba pero no en todos los países. Había euforia y optimismo después de la guerra de Viet-nam, Se libero África y empezaba el terrorismo en otros países, hubo una revolución americana.

Apareció la Liberación sexual, muchos pudieron salir del closet (Homosexuales y bisexuales) Empezó una nueva era. Se hizo popular la moda extravagante con Elvis Presley. Con la píldora y otros anticonceptivos el sexo pudo ser libre. Predomino el Edonismo: “Mi cuerpo es mío y puedo hacer con el lo que quiero” El fenómeno hippie y los cuerpos de paz habían diseminado por el mundo el gusto por las drogas y el sexo libre.

Luego vinieron los excesos: “Orgy rooms”: sexo por todos los orificios corporales y drogas sin límite. Sexo con “poppers”: Cápsulas de Nitrito de Amilo para dilatar el esfínter rectal y mejorar las relaciones homosexuales. El “Fisting” recepción anal del puño. El “Animal fisting” introducción anal de animales vivos. El “Golden Shower” orina con semen en la boca. En 1979 se detectan casos de sarcoma de Kaposi (Tumor Raro) y otras enfermedades extrañas en diferentes ciudades de E.E.U.U

Y súbitamente, en 1981 se detectó un incremento alarmante de varones jóvenes con antecedentes de homosexualidad y drogadicción con un marcado deterioro de su inmunidad y apareció el SIDA. El C.D.C de Atlanta define el Síndrome de inmunodeficiencia Humana en el año 1982,el nuevo virus pertenece al la familia de los retrovirus de los que ya se conocían 2 tipos: HTLV -1 y HTLV -2 ese mismo año se lo clasifica ese virus como HTLV III.

En 1985 se decide utilizar una única denominación del virus HIV, se aísla una variante que fue denominada HIV 2. En el año 1989 se detectó otra variante de virus HIV del tipo I, finalmente se definió HIV 1 sub tipo 0

Los Retrovirus Se dividen en 3 grupos: Oncovirus (virus causantes de cáncer): Los oncovirus se integran al genoma celular transformando eficientemente a las células infectadas que tienen el potencial de desarrollar tumores. HTLV I – II asociado a sindromes linfoproliferativos (Linfoma/Leucemia de celulaT) Lentivirus (virus de replicación lenta): producen infecciones persistentes a lo largo de la vida de las células infectadas.HIV-1,HIV-2. Espumavirus: Se han aislado de humanos y animales, pero no se han asociado a ninguna enfermedad específica

La Clasificación del VIH TIPOS: HIV-1 Grupos: Grupo M = Subtipos: A, B, C, D, F, G, H, J, K Responsable de la mayoría de infecciones en el mundo Grupo N = Raro. Encontrado originalmente en República de Camerún, Gabón y Francia. Grupo O = Identificado por primera vez en una mujer oriunda de la República de Camerún. HIV-2

Características del HIV : Genes Estructurales Gen gag: Codifica las proteínas del core (p24, p17 y p15). Se encuentran en la nucleocápside del virus, rodeando al ARN interno. Gen pol: Codifica la transcriptasa inversa, la proteasa y la polimerasa. Codifica la p10, p13, p66, p55 y p34 Gen env: Codifica las proteínas de la envoltura vírica.Estas proteínas son la gp120(de superficie) y la gp41(envoltura de transmenbrana) proteínas necesarias para adhesión y fusión con la célula a infectar.

CICLO REPLICATIVO DEL VIRUS

T lymphocyte in green and HIV in red

LISIS DE LINFOCITOS T CD 4 POR BROTAMIENTO VIRAL

COMPORTAMIENTO SEROLÓGICO:INFECCIÓN PRIMARIA POR VIH

Glicoproteinas de envoltura: gp120 – gp41 Proteinas de gag: p25 – p15 – p17

FLUÍDOS DE TRANSMISIÓN FLUIDOS DE NO TRANSMISIÓN Sangre Semen Líquido pre-seminal Secreciones vaginales Leche materna Lágrimas Sudor Saliva Orina Heces

Presentación Clínica Luego de la transmisión del VIH, cerca del 50% de sujetos desarrollará una enfermedad febril semejante a gripe con una o más de las siguientes condiciones: - Adenopatías - Rash cutáneo - Ulceras orales - Mialgias - Congestión faríngea - Cefalea - Diarrea - Náusea o vómito

Presentación Clínica Un pequeño porcentaje desarrolla hepatosplenomegalia Instalación de enfermedad: por lo general entre 1-6 semanas post-exposición y puede durar hasta 1-3 semanas El “Síndrome Retroviral Agudo”, a menudo es confundido con la gripe Una persona con los síntomas mencionados debe ser investigada en términos de factores de riesgo de exposición a VIH (RS sin protección, tatuajes, drogadicción endovenosa).

Diagnóstico por Laboratorio: La mayoría de los pacientes no se diagnostican en la fase aguda de la infección por varias razones. A - Por desarrollar una infección aguda de forma asintomático (10 – 20%) B - Tienen síntomas pero no consultan ( 20 – 40%). C – Consultan por síntomas pero el medico no piensa en una infección por HIV como causa de la sintomatología, o si lo hace no realiza las pruebas adecuadas aproximadamente 40% de los casos. Debido a que las pruebas serológicas de diagnostico habitual de infección para HIV se basa en la detección de anticuerpos y esta pruebas suelen ser negativas en la fase inicial de infección (periodo de ventana) la detección de infección aguda requiere la demostración del virus en sangre; lo que se debe hacer es pedir una prueba cuantitativa de CV (ARN- HIV)

Pruebas Serológicas de Cribado y Confirmación Búsqueda de Anticuerpos anti-HIV Pruebas o test Rápidos Elisa/EIA Confirmatorias: Western Blot LIA IFI Métodos Directos: Cultivo Vírico. Detección de Antigeno p24. Detección Molecular de ADN pro-vírico y ARN vírico ( PCR ADN ramificado (b-DNA)

Pruebas Rápidas por Inmunocromatografia : - Su uso dirigido para la evaluación y decisión rápida sobre la profilaxis medicamentosa mujeres con finalización del embarazo o en trabajo de parto que no fueron testeados con anterioridad. - No es diagnóstico y necesita de un examen confirmatorio. - De tener un examen positivo continuar luego del parto con EIA – Western Blot. - Sensibilidad 97% Especificidad 100%

TÉCNICA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA S G Anticuerpos de detección marcados con Oro Coloidal Antígeno en muestra Anticuerpo de Captura contra anticuerpo de detección Anticuerpo de Captura contra antígeno específico TIRA NITROCELULOSA

ELISA: Examen convencional de screening para infección por HIV Capacidad de detectar los 2 antígenos (HIV-1 e HIV-2) Elevado grado de sensibilidad y especificidad Falsos negativos – antes de la seroconversión (≈ 3 meses) Resultados posibles Positivo (altamente reactivo) Negativo (no reactivo) Indeterminado (parcial/ reactivo)

EIA

Generaciones ELISA-VIH PRIMERA GENERACIÓN Formato de sandwich Proteínas por Lisado viral Solo detectaban HIV-1 Conjugado formado por anti-Igs humanas (no dirigiadas contra HIV), unido a una enzima Solo detectan Acs tipo IgG SEGUNDA GENERACIÓN Formato sandwich Proteínas soporte fase sólida obtenidas por recombinante viral Incluye HIV-1 y HIV-2 Conjugado formado por Igs antihumanas (no dirigidas contra HIV), unido a una enzima Solo detectan Acs tipo IgG

CUARTA GENERACIÓN-HIV COMBO TERCERA GENERACIÓN Formato de sandwich HIV1-HIV2-Subtipos M - 0 Proteínas soporte fase sólida obtenidas por recombinante y péptidos sintéticos Conjugado específico formado por las mismas proteínas que soportan la fase sólida unido a una enzima Detectan Acs tipo IgM e IgG CUARTA GENERACIÓN-HIV COMBO Formato de sandwich HIV1-HIV2-Subtipo 0 G Proteínas soporte fase sólida obtenidas por recombinante y péptidos sintéticos Acs monoclonales específicos para p24 Conjugado específico formado por las mismas proteínas que soportan la fase sólida unido a una enzima Detectan Acs tipo IgM e IgG y Antígeno

¿Por qué es importante un ensayo HIV Combo? Los ensayos de anticuerpos de VIH detectan individuos con VIH (+) alrededor del día 22 Los ensayos HIV Combo detectan individuos con VIH (+) alrededor del día 17. Los ensayos HIV Combo deberían ser usados siempre para diagnosticar el VIH. Tercera Generación Ab Tercera Generación Ab HIV RNA (plasma) HIV RNA (plasma) HIV p24 Ag HIV p24 Ag HIV Cuarta Generación HIV Cuarta Generación HIV Ab de 3a gen HIV Ab de 3a gen 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Día Día Ventana: 3-5 días Ensayos Combo ‘más sensibles' Ventana: 3-5 días Ensayos Combo ‘más sensibles'

Prueba confirmatoria HIV1-HIV2 WESTERN BLOT Los ensayos Western Blot solo miden anticuerpos tipo IgG Una infección reciente puede dar negativo para un EstudioWestern Blot y tener resultados reactivos por ensayos de Tercera y Cuarta Generación

Examen de confirmación de diagnóstico mas comúnmente utilizado Western Blot Examen de confirmación de diagnóstico mas comúnmente utilizado Mas específico que ELISA – mide la totalidad de anticuerpos anti-HIV Detección de los anticuerpos contra los múltiples antígenos del HIV (con diferentes pesos moleculares) y su visualización como bandas distintas

Resultados posibles: Positivo Negativo Western Blot Resultados posibles: Positivo Existencia de anticuerpos contra 2 o 3 proteínas del HIV: p24, gp41 y gp120/160 Negativo ausencia de cualquer tipo de banda Indeterminado – individuo de bajo riesgo Explicación mas probable es que este presente anticuerpos que hacen reacción cruzada con una de las proteínas del HIV: p24 y/o p55 Explicación menos probable es que el individuo está infectado por el HIV y va a desarrollar una respuesta humoral clásica.

Western Blot

Western Blot

Western Blot

Western Blot

Western Blot

Western Blot

LIA

Test de captura de Ag p24 Tipo ELISA Uso mas frecuente: test de screening de infección por HIV en pacientes sospechosos de tener síndrome agudo por HIV. Aparece en sangre antes de los sintomas y desaparece con el aumento de anticuerpos.

Inmunofluorecencia indirecta

La duración del período de ventana serológica depende fundamentalmente de la sensibilidad de los métodos de detección. Ventana serológica

Test de detección directa de RNA-HIV PCR/TR y bDNA Test de detección directa de RNA-HIV Recurso diagnóstico: Infección aguda y neonatal Cuando los resultados de los examenes serológicos convencionales son indeterminados Determinación de pronóstico y monitoreo del tratamiento anti-HIV

PCR/TR y bDNA PCR-TR usado para estudios de diversidad de secuencias y resistencias de los virus a los anti-retrovirales. Elevada sensibilidad PCR-TR positivo en mas de 98% de pacientes bDNA positivo en mas de 90% de pacientes

FALSOS RESULTADOS EN EL DIAGNOSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓN POR VIH

FALSOS RESULTADOS EN SEROLOGIA DEL VIH FALSOS NEGATIVOS Evolución serológica: Estadios iniciales: PERIODO VENTANA (2 - 3 semanas) Ausencia de anticuerpos y presencia de antígeno p24 Estadios finales: desaparecen anticuerpos anti p24 anti p17 anti p55

FALSOS RESULTADOS EN SEROLOGIA DEL VIH

FALSOS RESULTADOS EN SEROLOGIA DEL VIH

FALSOS RESULTADOS EN SEROLOGIA DEL VIH

FALSOS RESULTADOS EN LA PRUEBA DE CONFIRMACIÓN CAUSA DE REACCIONES INDETERMIINADAS EN WB

Serología en Recién Nacidos Durante el embarazo ,los anticuerpos IgG de la madre atraviesan la placenta en forma pasiva; esto provee de inmunidad de 12 a18 meses después del nacimiento. Ninguna prueba serológica sirva para Dx. De infección en el R.N Técnica de elección de Dx perinatal: determinación cualitativa del ADN viral del HIV se obtiene de las células mononucleares de la sangre periférica por PCR, 95% de sensibilidad. Antígeno p24 por Elisa. Cultivo viral caro y engorroso

Clasificación Diagnóstica en R.N. Se considera infección intrauterina, cuando se aísla el virus en las primeras 48 horas de vida. Si es negativo inicialmente, y se aísla el virus entre los 7 a 10 días de vida se considera infección intraparto. Si el R.N. es negativo y se aísla el virus después de los 3 meses, se considera infección por leche materna.

En niños mayores de 18 meses el seguimiento diagnóstico será como la de un adulto: positividad de la prueba serológica EIA y confirmación por Wester Blot.

Recuento de células T CD4+ Medición de los niveles de RNA-HIV Monitoreo por Laboratorio Recuento de células T CD4+ Medición de los niveles de RNA-HIV Resistencia del HIV

Recuento de células T CD4+ Examen de rutina en evaluación de los individuos infectados por HIV. Mejor indicador del estado de inmunocompetencia imediata. Recuentos realizados en el momento del diagnóstico y cada 3 a 6 meses en adelante. Mediciones: <500/µl Inicio de terapia anti-retroviral <200/µl Profilaxia contra P.Carinii y Toxoplasma <50/µl Profilaxia contra CMV y micobacterias del complexo M. avium (MAC).

Asociación infecciones oportunistas y linfocitos CD4+ Cuenta de linfocitos CD4+ (cls/l) 400 Herpes zoster Tuberculosis 300 Candidiasis oral 200 Neumonía por P. carinii Candidiasis esofágica Herpes mucocutáneo 100 Toxoplasmosis, criptococosis, coccidiodo MAC, CMV Criptosporidiasis, PML 50 Tiempo

Niveles de RNA/HIV Deben ser medidos en el momento del diagnóstico de HIV y a seguir cada 3 a 4 meses en pacientes no tratados. Mediciones: >10.000 copias de RNA-HIV por mL de sangre → Inicio de tratamiento <50 copias de RNA-HIV por mL de sangre → Tratamiento eficaz

GRACIAS......