INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA EVALUACIÓN DE BIOAEROSOLES, BACTERIAS Y HONGOS, EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – BIOTECNOLOGÍA DE LA ESPE Y CONSTRUCCIÓN PREVIA DE UN MUESTREADOR DE BURBUJEO EXPERIMENTAL. Tesista: Andrés López M. Directora: M. Sc. Alma Koch Codirector: Ing. Mat. Pedro Romero

I. INTRODUCCIÓN Problemática Bioaerosoles Conjunto de partículas en suspensión de origen biológico variable en un medio gaseoso 0,001 – 1 µm 1 – 5 µm 5 – 10 µm Tamaño Fuentes Trabajadores Asociados a Enfermedades Rol ecológico

2. Objetivos de la Investigación I. INTRODUCCIÓN 2. Objetivos de la Investigación Objetivo General  Evaluar los bioaerosoles (bacterias y hongos) en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE y construir previamente un muestreador de burbujeo experimental. Objetivos Específicos Determinar la existencia de bioaerosoles. Establecer las posibles fuentes de emisión de bioaerosoles. Evaluar tareas y puestos de trabajo y su relación con los bioaerosoles. Construir un muestreador de burbujeo experimental en base al diseño de Agranovski et al. (2002). Tomar muestras de bioaerosoles con el muestreador de burbujeo experimental (Agranovski et al., 2002). Identificar las muestras de bioaerosoles recolectadas usando técnicas de cultivo convencionales. Cuantificar la concentración de bioaerosoles. Documentar la presencia de bioaerosoles.

I. INTRODUCCIÓN 3. Hipótesis Hipótesis nula La presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE no es significativa. Hipótesis alternativa La presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE es significativa.

II. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Participantes Área de Investigaciones Área de Docencia Tesista: Andrés López M. Directora: M. Sc. Alma Koch Codirector: Ing. Mat. Pedro Romero Personal del Laboratorio Estudiantes Centro de Investigaciones Científicas (CEINCI) de la ESPE Área de Biología Molecular 2. Zona de Estudio Investigación de campo y análisis de laboratorio: Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE (constituido por tres áreas).

II. MATERIALES Y MÉTODOS Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE. Área de Investigaciones, Área A. Área aproximada de 30,16 m2

II. MATERIALES Y MÉTODOS Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE. Área de Docencia, Área B. Área aproximada de 53,65 m2

II. MATERIALES Y MÉTODOS Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE. Área de Biología Molecular, Área C. Área aproximada de 46,34 m2

II. MATERIALES Y MÉTODOS 3. Diseño experimental (Gutiérrez & De La Vara, 2008). Diseño de bloques completos al azar (DBCA) Pruebas LSD de Fisher Shapiro Wilks Levene Independencia Modelo estadístico Hipótesis Arreglo de los datos en el DBCA para la investigación Número de tratamientos 3 áreas x 3 días x duplicado = 18

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4. Procedimientos Construcción del muestreador experimental De acuerdo al diseño de Agranovski et al. (2002), con modificaciones Inspección detallada del edificio Inspección exterior Inspección interior Descripción de actividades del área de trabajo Identificar los posibles mecanismos de propagación de bioaerosoles Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) De acuerdo a la norma NIOSH 0800 Bioerosols Sampling, con modificaciones Determinación de las concentraciones de bioaerosoles Partículas totales Bioaerosoles viables y no viables UFC/m3 Identificación de los bioaerosoles muestreados Mediante técnicas de Microbiología tradicional Bacterias (Género y especie) Hongos (Género)

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Construcción del muestreador experimental Diseño Muestreadores experimentales construidos Material de construcción Acrílico (b) Material de construcción PVC Esquema del muestreador: (a) vista tridimensional y vista lateral, y (b) vista de planta (Agranovski, Agranovski, Reponen, Willeke, & Grinshpun, 2002)

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Construcción del muestreador experimental Principio de funcionamiento Producción de burbujas para fotografías (Agranovski, Braddock, & Myojo, 1999) Muestreador en funcionamiento Absorción de aerosoles en burbujeo Circulación de aire en el interior de la burbuja Deposición inercial Sedimentación Difusión

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.2. Inspección detallada del edificio (exterior e interior) 4.3. Descripción de actividades del área de trabajo Registro de inspección exterior e interior Registro de actividades durante la evaluación

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Tipos de bioaerosoles a muestrear Bacterias y hongos Medios de cultivo Bacterias  Tripticase Soy Agar (TSA) con 0,04% de actidiona Hongos  Malt Extract Agar (MEA) con 0,01% de cloranfenicol Puntos de muestreo 2 puntos de muestreo por cada área Número de muestras 3 áreas x 3 días x duplicado = 18 Registro muestreo de bioaerosoles Tiempo y flujo de muestreo 8 h continuas diarias 4 L/min Temperatura, humedad relativa y presión atmosférica Fluido de recolección Tripticase Soy Broth (TSB)

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Limpieza y desinfección del equipo muestreador Limpieza Desinfección Equipos muestreadores sellados y listos Preparación de los equipos muestreadores Equipos muestreadores B1, B2 y B3 con 40 mL de medio TSB listos Relleno del dispositivo muestreador de bioaerosoles con 40 mL de medio TSB mediante un dosificador

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Uso del equipo muestreador In situ Equipos muestreadores B1, B2 y B3 Bombas de succión de aire Puntos de muestreo en área A

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Uso del equipo muestreador In situ Equipos muestreadores B1, B2 y B3 Puntos de muestreo en área B Bombas de succión de aire

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Uso del equipo muestreador In situ Equipos muestreadores B1, B2 y B3 Puntos de muestreo en área C Bombas de succión de aire

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos) Procesamiento de las muestras de bioaerosoles Volumen final (80 mL) Equipos al finalizar la toma de muestras División en alícuotas (40 mL) Refrigeración Enjuague y recuperación

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.5. Determinación de las concentraciones de bioaerosoles Recuento total de partículas biológicas y no biológicas Conteo en la Cámara de Neubauer Recuento de bioaerosoles viables y no viables Diluciones seriadas (10-1 y 10-3) y cultivo en medios MEA y TSA

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.5. Determinación de las concentraciones de bioaerosoles UFC/m3 de aire (Agranovski, Agranovski, Reponen, Willeke, & Grinshpun, 2002) Corrección de las mediciones observadas (TULAS, 2011)

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.6. Identificación de los bioaerosoles muestreados Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos) Evaluación morfológica, se escogieron las colonias distintas Aislamiento de bioaerosoles (bacterias y hongos) Medios de cultivo Bacterias  Tripticase Soy Agar (TSA) con 0,04% de actidiona Hongos  Malt Extract Agar (MEA) con 0,01% de cloranfenicol Algunas bacterias y hongos  Potato Dextrose Agar (PDA)

II. MATERIALES Y MÉTODOS 4.6. Identificación de los bioaerosoles muestreados Bacterias Hongos Tinción Gram Prueba de la Catalasa Prueba de Oxidasa Evaluación macroscópica Evaluación microscópica Técnica del celo Tinción de KOH y azul de metileno modificada Tinción Gram Determinación del género  Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 2001 Software Identax Bacterial identification System

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Construcción previa del muestreador de burbujeo experimental Equipos muestreadores B1, B2 y B3 (Agranovski et al., 2002) construidos para la Evaluación de Bioaerosoles (bacterias y hongos)

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 2. Inspecciones exterior e interior del edificio Buenas condiciones, Poco polvo No había evidencias visibles de fuentes microbianas, nutrientes o agua. No existen sistemas de ventilación o filtración de aire La infraestructura física (pisos, mesas de trabajo, ventanas) no cumplen con los requerimientos adecuados para un laboratorio de Microbiología. Interior Exterior Área B

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3. Actividades en el entorno de trabajo Área A Área B

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3. Actividades en el entorno de trabajo Área C Acciones comunes Movimiento del aire generado por Caminar Hablar Toser Estornudar Reaerolización de partículas del piso y de las superficies Fuentes: Bacterias  aire interior, ocupación humana, sus actividades Hongos  aire exterior, plantas, suelo

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4. Temperatura, humedad relativa y presión atmosférica Aumento temperatura Recuentos elevados de microorganismos y esporas de hongos en el aire Humedad relativa interior Desecación puede conducir a la pérdida de viabilidad

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5. Recuento total de partículas biológicas y no biológicas Observación de dos partículas (posibles bioaerosoles), 

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6. Recuento de bioaerosoles viables y no viables Conteo de bioaerosoles (bacterias y hongos) viables en el contador de colonias Quebec

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m3 Bacterias y hongos ANOVA Límites permisibles sugeridos Holanda  10000 UFC/m3 (p<0,05)

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m3 Bacterias ANOVA Límites permisibles sugeridos Unión Europea  10000 UFC/m3 OMS  500 UFC/m3 (p<0,05)

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m3 Hongos ANOVA Límites permisibles sugeridos Unión Europea  10000 UFC/m3 (p<0,05)

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 8. Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos) Selección de dos colonias distintas de bioaerosoles (bacterias), 

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 8. Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos) Selección de la colonia del bioaerosol hongo,  Selección de una colonia distinta de bioaerosoles (bacterias resistentes al cloranfenicol), 

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 9. Aislamiento de bioaerosoles (bacterias y hongos) Medio TSA Medio MEA Medio PDA

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 10. Identificación de los bioaerosoles bacterias Pruebas bioquímicas Antibiograma Catalasa Oxidasa Identax Tinción Gram

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 10. Identificación de los bioaerosoles hongos Hongo filamentoso Tinción de KOH y azul de metileno Técnica del celo (cinta adhesiva) Tinción Gram Bacterias resistentes al cloranfenicol Tinción de Azul de Lactofenol

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 11. Localización de los bioaerosoles encontrados Área de Investigaciones 7 especies 8 bacterias

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 11. Localización de los bioaerosoles encontrados Área de Docencia 11 especies 1 género 15 bacterias 1 hongo

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 11. Localización de los bioaerosoles encontrados Área de Biología Molecular 16 especies 18 bacterias

IV. CONCLUSIONES Las posibles fuentes de emisión de los bioaerosoles encontrados fueron el movimiento del aire generado por las personas al caminar, al hablar, toser, estornudar, la reaerolización de partículas del piso y de las superficies y también el aire proveniente del ambiente exterior. Se analizaron las tareas y puestos de trabajo durante la evaluación de bioaerosoles y se descubrió que la apertura y cierre de puertas constituye la acción predominante que probablemente permite la proliferación de los bioaerosoles, además de la presencia de seres humanos, otras actividades y el aire exterior. La viabilidad de los bioaerosoles en las tres áreas analizadas se mantuvo entre 0,654% y 2,386% y los factores principales que posiblemente los afectaron son la humedad y la temperatura ambiental durante la evaluación. El área de Biología Molecular registró la mayor concentración de bioaerosoles, la de Docencia mostró una concentración intermedia y la de Investigaciones reveló la menor concentración.

IV. CONCLUSIONES Se evidenció que casi todas las concentraciones de bioaerosoles detectadas excedieron los límites sugeridos por la Organización Mundial de la Salud, la Unión Europea, y Holanda. De las tres áreas del Laboratorio de Microbiología - Biotecnología se aislaron 42 bioaerosoles (41 bacterias y 1 hongo), 38 bioaerosoles bacterias fueron bacilos Gram negativos, mientras que 3 fueron bacilos Gram positivos, de igual manera se halló un sólo bioaerosol hongo filamentoso. Los bioaerosoles bacterias fueron predominantes sobre los hongos. Sobre los géneros de bioaerosoles descubiertos se obtuvo que 2 son de Enterobacter, 3 de Yersinia, 1 de Serratia, 5 de Ewingella, 4 de Burkholderia, 1 de Klebsiella, 2 de Proteus, 19 de Pseudomonas, 1 de Hafnia, 3 de Bacillus y 1 de Alternaria spp. Se comprobó que la presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos, en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE es significativa.

V. RECOMENDACIONES Se debería: Ampliar la información sobre bioaerosoles en el Ecuador realizando nuevas investigaciones en otros ambientes laborales. Investigar los bioaerosoles recolectados ya que algunos tienen diversas aplicaciones. Incrementar la concentración del agente antibacteriano cloranfenicol en el medio de cultivo MEA o utilizar otras alternativas. Extender el número de muestras y la inversión económica para mejorar la inferencia estadística.   Implementar algún sistema de control de bioaerosoles para disminuir sus concentraciones en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE. Rediseñar y adecuar las instalaciones del Laboratorio de Microbiología – Biotecnología de la ESPE para lograr un eficiente desarrollo de sus actividades.

AGRADECIMIENTOS A la Escuela Superior Politécnica del Ejército por el apoyo y recursos brindados. A mi querida madre Sarita, que me enseñó, apoyó y respaldó mis anhelos y sueños para convertirme en el ser humano que soy. A todos esos dilectos amigos y amigas de mi madre, que se preocuparon y me apoyaron para que culmine con éxito mi estudio. A M. Sc. Almita Koch Kaiser y al Ing.-Mat. Pedro Romero, Directora y Codirector de mi Tesis, por su acogida, respaldo y conocimientos brindados. A Ing. Jessie Maisincho y la Dra. Ligia Ayala por su apoyo y colaboración. A mis apreciados amigos y amigas.