IMPLEMENTACIÓN DE UN ENSAYO PCR MULTIPLEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS ENTEROVARIEDADES DE Escherichia coli PATÓGENAS Autora: Andrea Zambrano Cobos Directora: BSc. Karina Ponce Codirector: Dr. Marcelo Grijalva Sangolquí - Ecuador 2012

RESULTADOS Y DISCUSIÓN TABLA DE CONTENIDOS INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA

Aislamiento e identificación Escherichia coli (Enterobacteriaceae) CARACTERÍSTICAS: Anaerobio facultativo, Gram - Pared celular rígida y porosa Flagelos y pilis Membrana celular (lípidos y proteínas) Una sola cadena circular de ADN Aproximadamente 5000 genes Aislamiento e identificación Bioquímica Serotipificación

CATEGORIAS DIARREOGÉNICAS EPEC ETEC EIEC EHEC EAEC DAEC Métodos específicos de detección Poseer distintos factores de virulencia Causar un síndrome diarreico diferente Presentar distinta epidemiología Pertenecer a distintos serotipos O:H

MECANISMO DE PATOGENICIDAD depende E. coli diarreicas Variable Invasividad. Adherencia a la superficie de la mucosa. Producción de enterotoxinas. Producción de citotoxinas

ETAs EHEC: La distribución es universal. Los alimentos asociados a brotes son el arroz, carne contaminada, salsa de vainilla. ETEC: Diarrea del viajero. Países en desarrollo. La transmisión ocurre por la ingesta de alimentos o agua contaminados. EIEC: Genéticamente igual a Shigella spp. Presentan colitis inflamatoria y disentería. EPEC: En niños menores de 2 años. Elevadas tasas de morbilidad y mortalidad. Trasmisión por contaminación fecal EAEC: La causa más frecuente de diarrea persistente en lactantes DAEC: Predomina en pre-escolares, niños pequeños y lactantes

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Países desarrollados y subdesarrollados Datos epidemiológicos No existen reporte de E. coli patógenas

DETECCIÓN Propiedades bioquímicas Serotipo (Ciertas variedades) Reacciones inmunoenzimáticas Cultivos celulares 5. PCR 6. Hibridación de sondas Para estudios epidemiológicos PFGE, MLST

PCR MÚLTIPLEX Simple identificación Diagnóstico rápido Amplifica Simple identificación 2 ó más loci en la Rxn Diagnóstico rápido Alta confiabilidad Sensible y específico Esta correlacionado con la presencia de genes involucrados con la patogenicidad

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN Objetivo General Implementar un ensayo PCR múltiplex para la identificación de las enterovariedades de Escherichia coli patógenas  

Objetivos específicos Optimizar el sistema según los parámetros: Temperatura de hibridación, concentración de primers, tiempo y ciclos de amplificación Identificar los genes eltB y estA de E.coli enterotoxigénica, los genes vt1, vt2 y eaeA de E.coli enterohemorrágica, el gen ipaH de E.coli enteroinvasiva, el gen eaeA de E.coli enteropátogena, el gen aggR de E.coli enteroagregativa, el gen DA de E.coli difusa adherente   Determinar la sensibilidad analítica del sistema. Elaborar un protocolo de implementación del ensayo PCR multiplex para la identificación de las enterovariedades Escherichia coli patógenas.

EXPLORATORIO - CONFIRMATORIO MATERIALES Y MÉTODOS DISEÑO DE TIPO EXPLORATORIO - CONFIRMATORIO Optimización: [primers], Tº Hibridación, Ciclos y tiempo de amplificación. Diseño PCR Multiplex Sensibilidad Especificidad

Controles positivos y primers Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile y Dr. James Nataro de la Universidad de Virginia Cebadores DAEC EPEC EHEC EIEC EAEC ETEC Da eae vt1 vt2 ipaH aggR estA eltB 750pb 376pb 130pb 298pb 600pb 254pb 147pb 322 pb

Extracción ADN genómico Temperatura de hibridación Kit comercial de Promega Wizard Genomic DNA Purification OPTIMIZACIÓN Temperatura de hibridación Rango: 56ºC-68ºC

Concentración de Primers Tiempos de amplificación 0,2 uM - 0,4 uM - 0,5 uM - 0,75 uM - 1uM Tiempos de amplificación 1 min-45 seg- 30 seg DISEÑO DE PCR MULTIPLEX 1. Ensayo PCR: 8 pares primers en una Rxn 2. Ensayo PCR: Combinación de 2 pares de primers con cada DEC 3. Ensayo PCR: 2 PCR multiplex A y B

LÍMITE DE DETECCIÓN ESPECIFICIDAD Cepas de referencia : EHEC y ETEC Escherichia coli Escherichia coli ATCC 51313 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae Salmonella serotipo Enteritidis Vibrio cholerae

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Microbiología

ADN Genómico ETEC: 33,6ng/uL EPEC: 20,2 ng/uL EIEC: 17,8 ng/uL EHEC: 17,3 ng/uL EAEC: 47,5 ng/uL DAEC: 10,8 ng/uL

Temperatura de hibridación M ipaH ipaH ipaH ipaH eae eae eae eae EIEC-EPEC M eltB eltB eltB eltB aggR aggR aggR aggR ETEC-EAEC

EIEC-ECDA EHEC M ipaH ipaH ipaH ipaH Da Da Da Da M vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 c- EHEC

Concentración de cebadores 0,4 uM 0,2 uM vt1 Da Da Da vt1 eae eltB aggR Da eae eltB estA

Diseño PCR multiplex Pool DNA

Primer Ensayo

Concentración de primers

Segundo Ensayo PCR Dúplex

Tercer Ensayo

Tercer Ensayo MULTIPLEX A Y B B A A: EHEC-EPEC-DAEC B: ETEC-EIEC-EAEC

MULTIPLEX A Y B

Limite de detección Multiplex A : EHEC 0,0029 ng/uL Multiplex B : ETEC

ESPECIFICIDAD Amplifica E. coli patógenas!!! M ETEC Salm Vibrio K.pneu C- Amplifica E. coli patógenas!!!

Prueba de Campo Múltiplex A Múltiplex B EPEC ETEC M m1 m2 C1+ C1- m1 m2 C2+ C2- EPEC ETEC

Conclusiones Se logro detectar los 8 genes virulentos de la E. coli diarreicas en dos PCR multiplex Los parámetros que fueron optimizados en la PCR monoplex variaron al momento de diseñar la PCR multiplex. Las [primers] oscilan entre 0,1 uM a 1,25 uM, la Tº de hibridación optimizada fue de 57ºC, el tiempo de los pasos de la PCR fueron de 45”. Se dividió en 2 PCR multiplex: A identifica ECEH, ECEP, y ECDA. B identifica a ECET, ECEI, ECEA. La sensibilidad PCR multiplex A fue de 0,0029 ng/uL y B fue de 0,011 ng/uL. La especificidad del sistema se evaluó en otros microorganismos, resultando negativo la amplificación

Recomendaciones Realizar la técnica directamente desde las muestras de heces o desde la bacteria, aislando el ADN mediante kits comerciales. Antes de diseñar la PCR multiplex optimizar la temperatura de hibridación de cada cebador y la concentraciones de los mismos. Usar la PCR múltiplex para investigar un número elevado de microorganismos. Hacer uso de esta técnica para estudios a mayor escala como es la prevalencia de las diferentes enterovariedades de E. coli, caracterización genotípica, etc.

AGRADECIMIENTOS