Enzimología clínica Concepto: área de la Bioquímica clínica que abarca la determinación de enzimas biológicas, que normalmente circulan en mínimas cantidades en el plasma y un aumento de su concentración lo convierte en un buen indicador del daño celular o de la alteración fisiológica de algún órgano. Aumento de actividad enzimática del plasma Indicador sensible del daño celular al campo de la medicina en: Fisiopatología: Su Aplicación La vigilancia del curso del tratamiento El diagnóstico de enfermedades El pronóstico de enfermedades La detección de anomalías fisiológicas

Propiedades y Funciones de las enzimas: Son agentes químicos de naturaleza proteica que actúan como catalizadores de reacciones bioquímicas, acelerando la velocidad de las reacciones biológicas. Transforma uno o mas sustratos en productos Actúan en mínimas proporciones No se altera ni se consumen durante la reacción que catalizan Por su naturaleza proteica están sujetas a la desnaturalización Aceleran la velocidad de reacción pero no altera la constante de equilibrio Hace que las reacciones se lleven a cabo en tiempo y temperatura compatibles con la vida

Enzima Conjugada Las enzimas pueden ejercer su actividad catalítica en forma solitaria ó a través de un complejo conocido como: A la enzima conjugada se la conoce también como Holoenzima Son las que requieren de un cofactor para ejercer su acción catalítica. Los cofactores pueden ser compuestos inorgánicos como iones metálicos (Ca++, Mg++, Fe++, Pb++, Zn++) Si el cofactor es de origen orgánico recibe el nombre de coenzima, como las vitaminas, el NAD o NADP y las APOPROTEÍNAS. El enlace del cofactor o la coenzima puede ser intermitente o permanente La porción de la enzima que se une al cofactor o coenzima se denomina apoenzima

Sitio activo de la enzima Es un sitio específico de unión de la enzima con el sustrato, necesario para que la enzima ejerza su actividad catalítica La enzima tiene especificidad en la mayoría de las veces absoluta con respecto al sustrato De la formación del complejo E-S depende la velocidad de reacción para la formación del producto (P)

La actividad catalítica de una enzima, depende de las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de la molécula proteica que la forma y a su vez la estabilidad de la misma depende sobre todo de la temperatura, el pH y la concentración de sales del medio en que se encuentre.

Unidad de medida de las enzimas biológicas Debido a la baja concentración de las enzimas en el líquido extracelular lo que se determina en el análisis es la actividad enzimática y no la concentración, se mide su funcionalidad y no la cantidad. La actividad enzimática se expresa de acuerdo al SI de medición en U/l o UI/l Un U/l es igual a la cantidad de enzima capaz de producir un umol/min de producto a 25ºC en condiciones estándares Según la IUB ( UNION INTERNACIONAL DE BIOQ), la IFCC ( FEDERACION INTERNACIONAL DE QUIM. CLIN.) y la IUPAC ( UNION INTERNAC. DE QCA. PURA APLICADA)l. se debería emplear el Katal/litro.

1 Katal : 1 mol de sustrato catalizado por segundo. Esta unidad de medida aun no se emplea en todos los laboratorios clínicos, siendo la U/l la mas empleada. * Se puede realizar la conversión de U/l a K/l ó nK/l 1U= micromol/ min x 10-6 mol/umol x 1min/60 seg= 1.67 x 10-8 K = 16.7 nK ( nanokatales) En resumen: la actividad de una enzima se mide mediante la determinación de la cantidad de sustrato transformado por unidad de tiempo, bajo estrictas condiciones exactamente definidas.

Factores que influyen sobre la actividad enzimática La velocidad de reacción catalizada por enzimas varía ante la influencia de diversos factores tales como: Concentración del sustrato 2. Concentración de la enzima 4. pH 3. Temperatura 6. Presencia de inhibidores 5. Presencia de activadores

A- Concentración del sustrato Un factor limitante muy importante en las reacciones enzimáticas es la CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. De acuerdo a la hipótesis de Michaelis y Menten la velocidad de la reacción aumenta a medida que se forma el complejo enzima sustrato (ES) E + S ES P + E

La reacción al principio sigue una CINETICA DE PRIMER ORDEN, porque la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato (Velocidad variable) Si la concentración del sustrato es bastante alta para saturar toda la enzima disponible y la velocidad de reacción alcanza su máximo, la reacción esta en CINETICA DE ORDEN CERO (velocidad constante) y se hace independiente de la concentración del sustrato; dependiendo solo de la concentración de la enzima.

Cinética de las reacciones enzimáticas

CONSTANTE Km Deriva de la teoría de Michaelis – Menten, y es una relación entre la velocidad de una reacción enzimática y la concentración del sustrato. E + S K1 K2 ES K3 P + E El paso que limita la velocidad de reacción es la formación de producto a partir del complejo E-S.

De acuerdo a la curva de M. M De acuerdo a la curva de M.M. vemos que la constante Km es la concentración de sustrato a la que la enzima produce la mitad de la velocidad máxima de la reacción. POR LO TANTO: Km indica la cantidad de sustrato necesaria para cada reacción enzimática.

La hipótesis de M.M. puede representarse matemáticamente de la siguiente forma: V = Vmax [S] Km + [S] V = Velocidad de reacción que mide Vmax = Velocidad máxima [S] = Concentración del sustrato Km = Constante de M.M. de enzima para sustrato especifico.

En la curva hiperbólica de M. M En la curva hiperbólica de M.M. si hace difícil determinar el valor de la Km por lo que se emplea la recíproca de la fórmula de M.M. Que se representa en el gráfico de Lineaweaver - Burk

IMPORTANTE: Para asegurar que la reacción enzimática sea medida en Cinética de Orden Cero la concentración del sustrato debe ser 100 veces mayor a Km. [S] >> Km x 100 = Cinética de Orden Cero Si Km = o > a [S] = Cinética de Orden I.

B- Concentración de enzima También es determinante de la velocidad de reacción. Cuando se alcanza una concentración de sustrato que excede a la concentración de la enzima, la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de la enzima. Mientras más alta sea la concentración de la enzima la reacción se producirá con más rapidez porque hay mayor probabilidad de que se forme el complejo E-S.

C- pH Como las Enzimas son proteínas, los cambios de pH puede alterar la carga molecular neta y puede afectar su estado iónico, dando lugar a cambios estructurales o cambio en la carga que puede afectar al sitio activo, además el cambio de pH puede producir desnaturalización de la enzima. El pH ideal para que se produzcan las reacciones enzimáticas es de 6 a 8, pudiendo haber enzimas que son activas a pH mas bajo y otras a pH mas elevado. IMPORTANTE: En el laboratorio el pH de una reacción se controla empleando soluciones amortiguadoras o Buffer adecuados para cada reacción; de tal manera a asegurar que no haya variación del pH optimo durante la reacción.

D- Temperatura Con el aumento de la temperatura, también aumenta la velocidad de una reacción enzimática, esto se debe a que aumenta el movimiento de las moléculas y hay probabilidad de mayor colisiones entre la enzima y el sustrato. El peligro que representa un gran aumento de la temperatura es la desnaturalización que pueden sufrir las enzimas ( Las Proteínas son sensibles al aumento de la temperatura).

IMPORTANTE: Las enzimas deben ser analizadas bajo condiciones de temperatura controladas en forma estricta, durante la reacción la temperatura debe ser exacta, con una variación que no debe exceder + - 0.1 ºC Por cada incremento de temperatura de 10 º C, la velocidad de la reacción aumenta casi al doble, hasta que se produzca la desnaturalización de la enzima. Por cada grado de temperatura que aumenta, la velocidad de reacción enzimática aumenta en un 10 %. La temperatura óptima de la mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas es la temperatura corporal (37 ºC) Sin embargo lo importante es mantener constante la temperatura durante toda la reacción.

La desnaturalización se incrementa a medida que sube la temperatura y normalmente es significativa entre 40 a 50º C. Por lo general la temperatura de análisis para medir enzimas puede ser 25ºC, 30ºC o 37ºC; y para cada temperatura de trabajo cambia el rango de referencia. Las temperaturas bajas vuelven reversiblemente inactivas a las enzimas; es por ello que para la mayoría de las enzimas se sugiere refrigerar o mejor congelar el suero, evitando los ciclos de congelamiento y descongelamiento ( produce desnaturalización)

E- Activadores o Cofactores Son elementos no proteicos que pueden unirse con enzimas específicas incrementando la velocidad de reacción. Los activadores pueden ser: Iones metálicos (Ca++, Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ y K+) Las coenzimas como el NAD; NADH, las vitaminas, también son activadores de ciertas reacciones enzimáticas. El exceso del activador puede actuar inhibiendo la reacción.

Mecanismo de acción de los activadores Puede servir para: Enlazar el sustrato a la enzima Favorecer procesos de Oxido – reducción Alternar la configuración espacial de la enzima para la unión con el sustrato.

F- Inhibidores Son sustancias que interfieren con la reacción Los inhibidores pueden ser de 3 tipos: Inhibidores Competitivos Inhibidores No Competitivos Inhibidores Acompetitivos

Inhibidores Competitivos Se unen al sitio activo de la enzima y compiten con el sustrato por el sitio activo. Se puede solucionar la interferencia de éste tipo de inhibidores aumentando considerablemente la concentración del sustrato, de manera que el efecto del inhibidor sea insignificante, ya que va a existir mayor probabilidad de formación del complejo E-S.

Inhibidores No Competitivos El inhibidor no competitivo se une con la enzima en un lugar distinto al sitio activo, impidiendo una buena formación de producto y por lo tanto afectando la cinética de la reacción. Esta inhibición puede ser reversible si el inhibidor destruye parte de la enzima que participa en la actividad catalítica, y no se soluciona la inhibición si se aumenta la concentración del sustrato.

Inhibidores Acompetitivos Es otra clase de inhibición en la que el inhibidor se une con el complejo ES; incrementar la concentración de sustrato produce más complejos ES con los que se une el inhibidor y, por consiguiente, se incrementa la inhibición. El complejo enzima-sustrato-inhibidor no da producto.

CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS Oxidoreductasas: Enzimas que catalizan la reacción de óxido-reducción entre dos sustratos. Ej: LD, HDH, G-6-PD Transferasas: Catalizan la transferencia de un grupo químico, como el amino o fosfato, de una molécula a otra. GGT, AST; ALT;CK 3. Hidrolasas: Catalizan la rotura hidrolítica de compuestos: LPS; CHS; ALP; ACP; AMS; LAP; 5´NT

4. Liasas: Hidrolizan uniones C-O, C-N y C-C por eliminación, con la formación de un doble enlace, o bien la reacción inversa, que consiste en la adición de un grupo a un doble enlace.ej:ALS 5. Isomerasas: Catalizan los cambios geométricos o estructurales en una molécula.PHI (Isomerasa de fosfohexosa) 6. Ligasas: Catalizan la unión de dos moléculas, que se aparean y la hidrólisis de un enlace pirofosfato en el ATP o algún componente similar

NOMENCLATURA Y CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS