DESARROLLO DEL LINFOCITO Y REORDENAMIENTO DEL GEN DEL RECEPTOR PARA EL ANTÍGENO DRA. SIDONIA SUAZO

GENERALIDADES DEL DESARROLLO DEL LINFOCITO El proceso mediante el cual los progenitores de los linfocitos se diferencian en linfocitos maduros que van a poblar los tejidos linfáticos periféricos se conoce como desarrollo linfocítico o maduración linfocítica. El conjunto de receptores del antígeno, y por tanto de especificidades que expresan los linfocitos B y T compone el repertorio inmunitario. La reorganización y la expresión de los genes de los receptores de antígeno son datos fundamentales del desarrollo de los linfocitos, y fenómenos moleculares y celulares muy similares caracterizan al desarrollo temprano de los linfocitos B y T.

GENERALIDADES DEL DESARROLLO DEL LINFOCITO

La maduración de los linfocitos B y T se produce en los órganos linfáticos generadores (centrales): Compromiso de las células progenitoras hacia el linaje de los linfocitos B o T Reorganización de los genes de los receptores del antígeno Fenómenos de selección que garantizaran que sólo madurarán y entrarán en el sistema inmunitario periférico los linfocitos que expresen receptores funcionales. Proliferación de células progenitoras. Diferenciación de los linfocitos B y T hacia subpoblaciones diferenciadas funcional y fenotípicamente. Los linfocitos B se transforman en linfocitos B foliculares, de la zona marginal y B-1, y los linfocitos T se transforman en linfocitos T CD4 cooperadores y CD8 citotóxicos.

COMPROMISO EN LAS LÍNEAS DE LOS LINFOCITOS B Y T Y PROLIFERACIÓN DE PROGENITORES Las células troncales pluripotentes de la médula ósea y del hígado fetal (Células troncales hematopoyéticas CTH) dan lugar a todos los linajes de células de la sangre. Las CTH maduran para convertirse en los progenitores linfocíticos comunes PLC y que pueden dar lugar a los linfocitos B, linfocitos T, linfocitos NK y algunas células dendríticas.

COMPROMISO EN LAS LÍNEAS DE LOS LINFOCITOS B Y T Y PROLIFERACIÓN DE PROGENITORES El compromiso hacia el linaje B o T depende de las instrucciones recibidas desde la superficie celular, seguidas por la inducción de reguladores de la transcripción específicos que llevan a un PLC a asumir específicamente un destino de linfocito B o linfocito T. El desarrollo temprano de los linfocitos B y T se caracteriza por la proliferación de los progenitores, estimulados principalmente por la citocina interleucina-7 IL-7, lo que da lugar a un aumento acentuado del número de linfocitos. Las mutaciones en una cadena del receptor de la IL-7, denominada cadena γ común porque la comparten varios receptores de citocinas, dan lugar a una inmunodeficiencia en los seres humanos denominada enfermedad por inmunodeficiencia combinada grave ligada al X. Se caracteriza por un bloqueo principalmente del desarrollo de los linfocitos T. Sólo los linfocitos que expresan receptores funcionales pueden avanzar hasta la fase siguiente.

COMPROMISO EN LAS LÍNEAS DE LOS LINFOCITOS B Y T Y PROLIFERACIÓN DE PROGENITORES

EPIGENÉTICA, MICRO-ARN Y DESARROLLO DEL LINFOCITO

REORDENAMIENTO GÉNICO Y EXPRESIÓN DEL RECEPTOR PARA EL ANTÍGENO La reorganización de los genes de los receptores del antígeno es el fenómeno fundamental del desarrollo de los linfocitos que dirige la generación de un repertorio diverso. Los genes de los receptores del antígeno funcionales se producen en los linfocitos B inmaduros en la médula ósea y en los linfocitos T inmaduros en el timo mediante un proceso de reorganización génica, que tiene como objetivo generar un gran número de exones que codifican la región variable utilizando una fracción relativamente pequeña del genoma. Los fenómenos de reorganización del ADN que dan lugar a la producción de los receptores del antígeno NO dependen de la presencia de antígenos ni están influidos por ellos, es decir, los receptores del antígeno se expresan antes del encuentro con los antígenos.

REORDENAMIENTO GÉNICO Y EXPRESIÓN DEL RECEPTOR PARA EL ANTÍGENO

PROCESOS DE SELECCIÓN QUE MODELAN LOS REPERTORIOS DE LOS LINFOCITOS B Y T Los prerreceptores del antígeno y los receptores del antígeno envían señales a los linfocitos en desarrollo, que son necesarios para la supervivencia de estos linfocitos y para su proliferación y su maduración continuas. La reorganización de los genes de las Ig y de los receptores de los linfocitos T supone la adición y eliminación aleatorias de bases entre los segmentos génicos que se unen entre sí a fin de aumentar al máximo la diversidad. En esta fase inmadura se pueden eliminar células potencialmente perjudiciales que reconocen con avidez estructuras propias, o se les puede inducir a que alteren sus receptores de antígeno, y se pueden conservar las células que expresan receptores del antígeno útiles. La conservación de especificidades útiles supones un proceso denominado selección positiva.

PROCESOS DE SELECCIÓN QUE MODELAN LOS REPERTORIOS DE LOS LINFOCITOS B Y T La selección positiva proporciona señales para la supervivencia tanto de los linfocitos B como de los linfocitos T que han reorganizado correctamente ambas cadenas de sus receptores del antígeno. La selección negativa es el proceso que elimina o altera los linfocitos en desarrollo cuyos receptores del antígeno se unen fuertemente a los antígenos propios presentes en los órganos linfáticos generadores. Los linfocitos T en desarrollo con una afinidad elevada por los autoantígenos son eliminados mediante apoptosis, un fenómeno conocido como eliminación clonal. Se puede inducir a los linfocitos B inmaduros intensamente autorreactivos a que hagan más reorganizaciones del gen de las Ig y de esta manera escapen a la autorreactividad, fenómeno denominado edición del receptor.

REORDENAMIENTO DE LOS GENES DEL RECEPTOR PARA EL ANTÍGENO EN LOS LINFOCITOS B Y T Organización en línea germinal de los genes de las Ig y los RLT Las organizaciones de los locus génicos de las IG y de los RLT son muy similares y se caracterizan por la separación espacial de las secuencias que se deben unir entre sí para producir genes funcionales que codifican las proteínas de los receptores del antígeno. El locus de la cadena pesada de las Ig tiene 9 genes C, dispuestos en una organización en tándem, que codifican las regiones C de los 9 isotipos y subtipos diferentes de las Ig. La unión VDJ que incluye los segmentos D y J y todos los aminoácidos de unión en el de caso de las IgH ( y las cadenas β de los RLT), o la unión VJ que incluye los segmentos y las secuencias de unión en el caso de las cadenas ligeras de las IgG ( o α del RLT), componen la tercera región hipervariable, también conocida como determinante de la complementariedad (CDR3) de las moléculas de anticuerpos y los RLT, CDR1 y CDR2 son codificadas en la línea germinal en cada uno de los segmentos génicos V.

ORGANIZACIÓN EN LÍNEA GERMINAL DE LOS GENES DE IG Y DEL TCR Los dominios V y C de las moléculas de IgG (y de los RLT) comparten características estructurales que incluyen una estructura terciaria denominada plegamiento de las Ig. Las proteínas que incluyen esta estructura son miembros de la superfamilia de las Ig. Las secuencias no codificadoras de los locus de las Ig tienen funciones importantes en la recombinación y la expresión génica. Las secuencias que dictan la recombinación de diferentes segmentos génicos están adyacentes a cada uno de los segmentos codificadores en los genes de las Ig. También hay promotores génicos V, y otros elementos reguladores de actuación cis, como las regiones de control de los locus, los potenciadores y los silenciadores, que regulan la expresión génica a nivel de la transcripción. Como en el caso de las moléculas de Ig, los dominios V y C del RLT adoptan una estructura terciaria en un plegamiento de Ig, y por lo tanto el RLT es un miembro de la superfamilia de proteínas de las Ig.

RECOMBINACIÓN V(D)J Los genes en la línea germinal no se pueden transcribir en un ARNm que dé lugar a las proteínas de los receptores del antígeno. Los genes funcionales de los receptores del antígeno se crean sólo en los linfocitos B y T en desarrollo después de los fenómenos de reorganización del ADN que hacen que segmentos génicos V, (D) y J seleccionados aleatoriamente se sitúen contiguos unos a otros. Este proceso de recombinación supone varios pasos secuenciales. Inicialmente la cromatina se debe abrir en regiones específicas del cromosoma del receptor del antígeno para hacer que los segmentos génicos seleccionados aleatoriamente sean accesibles a la maquinaria de la recombinación. La recombinación supone la unión de los segmentos génicos correctos a través de inmensas distancias cromosómicas. Después se introducen escisiones en el ADN bicatenario en los extremos de estos segmentos, se añaden o se eliminan nucleótidos en los extremos rotos y finalmente los extremos procesados se ligan para producir genes de los receptores del antígeno en cada clon únicos pero diversos que se pueden transcribir de forma eficiente.

RECOMBINACIÓN V(D)J

Mecanismos de la recombinación V(D)J La reorganización de los genes de las Ig y del RLT representan un tipo especial de fenómeno de recombinación no homóloga del ADN, mediado por las actividades coordinadas de varias enzimas, algunas de las cuales se encuentran sólo en los linfocitos en desarrollo, mientras que otras son enzimas ubicuas para la reparación de las roturas del ADN bicatenario. Los factores críticos específicos de los linfocitos que median la recombinación V(D)J reconocen cierta secuencias de ADN denominadas secuencias señal para recombinación (SSR).

RECOMBINACIÓN V(D)J Mecanismos de la recombinación V(D)J La mayor parte de las reorganizaciones génicas de las Ig y de los RLT se produce mediante eliminación; se produce reorganización mediante inversión en hasta el 50% de las reorganizaciones del locus Igk. El proceso de recombinación V(D)J se puede dividir en 4 fenómenos diferentes que suceden de forma secuencial: Dos proteínas codificadas por genes específicos del tejido linfático, denominados gen I de recombinación-activación y gen 2 de recombinación activación (Rag-1 y Rag-2) forman un complejo tetramérico que tiene una función importante en la recombinación V(D)J. La importancia de los genes Rag se manifiesta por el hallazgo de que los ratones con inactivación génica que carecen de Rag-1 o de Rag-2 no pueden producir las proteínas de las Ig y de los RLT y carecen de linfocitos B y T maduros.

RECOMBINACIÓN V(D)J Las proteínas Rag-1 y Rag-2 muestran varias propiedades importantes –Son específicas de tipo celular y son producidas sólo en células de los linajes de los linfocitos B y T. –Se expresan sólo en linfocitos inmaduros. –Se expresan principalmente en las fases G0 y G1 del ciclo celular y están silenciados en las células en proliferación. Se piensa que la restricción de la escisión y la recombinación el ADN a células que no se están dividiendo reduce al mínimo el riesgo de generar roturas inadecuadas del ADN durante la replicación el ADN o durante mitosis. La misma recombinasa media la reorganización en los locus de las Ig y del RLT. Es probable que la accesibilidad de los locus de las Ig a la recombinasa esté regulada de forma diferencial en los linfocitos B y T en desarrollo por varios mecanismos, como alteraciones de la estructura de la cromatina, metilación del ADN y actividad transcripcional basal en los locus no reorganizados. Otra enzima específica del tejido linfático es la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT). También está la Artemisa que es una endonucleasa que abre las horquillas en los extremos codificadores, en su ausencia las horquillas no se pueden abrir y no se puede generar linfocitos T y B.

GENERACIÓN DE DIVERSIDAD EN LOS LINFOCITOS B Y T La enorme diversidad de los repertorios de los linfocitos B y T maduros se genera principalmente por la reorganización de los genes de las Ig y del RLT. Varios mecanismos génicos contribuyen a esa diversidad.  Diversidad combinatoria: los fenómenos de recombinación V(D)J afectan a múltiples segmentos génicos en la línea germinal que se pueden combinar de forma aleatoria, y diferentes combinaciones producen diferentes receptores de antígeno.  Diversidad de unión: la mayor contribución a la diversidad de los receptores del antígeno procede de la eliminación o la adición de nucleótidos entre los segmentos V y D, D y J o V y J en el momento de la unión. Estos procesos dan lugar a variabilidad en las uniones de los segmentos génicos V, D y J, lo que se denomina diversidad de la unión. Debido a la diversidad de la unión, las moléculas de antígenos y RLT muestran su variabilidad máxima en las uniones de las regiones V y C que forman la tercera región hipervariable, o CDR3.

DESARROLLO DEL LINFOCITO B Los principales fenómenos durante la maduración de los linfocitos B son la reorganización y la expresión de los genes de las Ig en un orden preciso, la selección y la proliferación de los linfocitos B en desarrollo e el punto de verificación del prerreceptor del antígeno y la selección del repertorio de los linfocitos B maduros. Antes del nacimiento los linfocitos B se desarrollan a partir de los precursores comprometidos en el hígado fetal, después del nacimiento los linfocitos B se generan en la médula ósea. La mayoría de los linfocitos se originan en progenitores de la médula ósea adulta que inicialmente no expresan Ig, se convierten en linfocitos B inmaduros que expresan moléculas de IgM unidas ala membrana y después salen de la médula ósea para madurar principalmente en el bazo, donde los linfocitos B del linaje de los linfocitos B foliculares expresan IgM e IgD en su superficie celular. En el bazo estas células adquieren la capacidad de recircular y de poblar todos los órganos linfáticos periféricos. Los linfocitos B foliculares y recirculantes se dirigen específicamente a los folículos linfáticos y tienen la capacidad de reconocer antígenos extraños y de responder a ellos. Se estima que el desarrollo de un linfocito B maduro a partir de un progenitor linfocítico tarde de 2 a 3 días en los seres humanos.

DESARROLLO DEL LINFOCITO B

El fenómeno denominado exclusión alélica contribuye a garantizar que todos los linfocitos B expresen un único receptor, manteniendo de esta forma la especificidad clonal, si ambos alelos experimentan reorganizaciones no productivas del gen de la IgH, la célula en desarrollo no puede producir cadenas pesadas de Ig, no puede generar una señal de supervivencia dependiente del pre-RLB y de esta forma experimenta la muerte celular programada. Esto ocurre con frecuencia y en parte explica por qué sólo una pequeña proporción de las células que se originan en los progenitores de los linfocitos B se convierten en linfocitos B maduros.

ESTADIOS DEL DESARROLLO DEL LINFOCITO B La selección positiva parece ser un fenómeno general dirigido a identificar linfocitos que han finalizado su programa de reorganización con éxito y posiblemente facilitar el compromiso del linaje en los subconjuntos de linfocitos T o B. Se piensa que sólo los linfocitos B que expresan moléculas de Ig de membrana funcionales reciben señales de supervivencia constitutivas derivadas del RLB. Se puede inducir a los linfocitos B inmaduros que reconocen autoantígenos con elevada avidez a que modifiquen sus especificidades mediante un proceso denominado edición del receptor. Los linfocitos B inmaduros que expresan receptores con afinidad elevada por autoantígenos y que entran en contacto con estos antígenos en la médula ósea también pueden morir o pueden no seguir madurando más si no son editados. La eliminación se denomina generalmente selección negativa, y es responsable en parte de mantener la tolerancia de los linfocitos B a los autoantígenos que están presentes en la médula ósea. Una vez que se ha hecho la transición a la fase de linfocito B maduro IgD IgM, el reconocimiento del antígeno lleva a la proliferación y diferenciación, no a la apoptosis ni a la edición del receptor. En consecuencia, se activan los linfocitos B maduros que reconocen los antígenos con afinidad elevada en los tejidos linfáticos periféricos, y este proceso da lugar a las respuestas inmunitarias humorales.

ESTADIOS DEL DESARROLLO DEL LINFOCITO B

SELECCIÓN DEL REPERTORIO DE LINFOCITOS B MADUROS Un subconjunto de linfocitos B, denominados linfocitos B B-1, difiere de la mayoría de los linfocitos B y se transforma de una forma única. Los linfocitos B de la zona marginal están localizados principalmente en la vecindad de los senos marginales del bazo y son en algunos aspectos similares a los linfocitos B-1 en relación con su escasa diversidad y su capacidad de responder a los antígenos polisacáridos y de generar anticuerpos naturales. Los linfocitos B de la zona marginal expresan la IgM y el marcador de superficie CD21. Responden muy rápidamente a los gérmenes transportados por la sangre y se diferencian en células plasmáticas de vida corta secretoras de IgM. Aunque generalmente median las respuestas inmunitarias independientes de los linfocitos T a los patógenos circulantes, los linfocitos B de la zona marginal también parecen capaces de mediar algunas respuestas inmunitarias dependientes de los linfocitos T.

DESARROLLO DEL LINFOCITO T La maduración de los linfocitos T a partir de los progenitores comprometidos supone la reorganización secuencial y la expresión de los genes del RLT, la proliferación celular, la selección inducida por el antígeno y la adquisición de capacidades funcionales. El timo es el principal punto de maduración de los linfocitos T. El timo involuciona con la edad; puede ocurrir que el resto del timo involucionado sea adecuado para mantener cierta maduración de los linfocitos T. Como los linfocitos T de memoria tienen una esperanza de vida prolongada (tal vez más de 20 años) y se acumulan con la edad, la necesidad de generar nuevos linfocitos T disminuye a medida que las personas envejecen.

DESARROLLO DEL LINFOCITO T

Los linfocitos T se originan en precursores que se originan en el hígado fetal y en la médula ósea adulta que pueblan el timo. Los linfocitos T en desarrollo en el timo se denominan timocitos, migran hacia la corteza del timo donde se produce la mayoría de los fenómenos posteriores de maduración. A medida que estos timocitos pasan por las fases finales de la maduración, migran desde la corteza hasta la médula y después salen del timo a través de la circulación.

DESARROLLO DEL LINFOCITO T Dos tipos de moléculas producidas por las células tímicas no linfocíticas son importantes para la maduración de los linfocitos T. El primero son las moléculas del CDP de la clase I y de la clase II, que se expresan en las células epiteliales y las células dendríticas del timo. La maduración de los linfocitos T en el timo también progresa en fases que se distinguen por la expresión de los genes del receptor del antígeno, las moléculas correceptoras CD4 y CD8, y su localización en el timo. Los inmigrantes del linaje T más tempranos que llegan al timo no expresan RLT ni moléculas CD4 ni CD8. Los linfocitos T en desarrollo en el interior del timo, denominados timocitos, pueblan inicialmente la corteza externa, donde experimentan proliferación, reorganización de los genes del RLT y expresión en la superficie de moléculas de CD3, RLT, CD4 y CD8. A medida que las células maduran, migran desde la corteza hasta la médula. Los

PAPEL DEL TIMO EN LA MADURACIÓN DEL LINFOCITO T Los timocitos menos maduros, denominados linfocitos pro-T son CD4-CD8 (negativos dobles) y los genes de los RLT es´tan en la configuración en la línea germinal. En la fase de linfocito pre-T, los timocitos siguen siendo negativos dobles, pero se ha finalizado la recombinación V-D-J en el locus de la cadena β del RLT. Los transcritos primarios de la cadena β se expresan y procesan para llevar un segmento C β adyacente al complejo VDJ, y se producen polipéptidos de la cadena β. La cadena β se asocia a la proteína pre-T α invariable para formar un pre- RLT. El pre-RLT transduce señales que inhiben la reorganización del alelo de la otra cadena β (exclusión alélica) y favorece la expresión de CD4 y CD8 y la proliferación adicional de timocitos inmaduros. En la fase CD4+CD88 (positiva doble) del desarrollo de los linfocitos T se produce la recombinación V-J en el locus α del RLT, se producen polipéptidos de la cadena α y se expresan concentraciones bajas del RLT en la superficie celular.

PAPEL DEL TIMO EN LA MADURACIÓN DEL LINFOCITO T Los procesos de selección dirigen la maduración de los timocitos positivos dobles que expresan RLT y moldean el repertorio de los linfocitos T hacia la restricción por el CPH propio y la autotolerancia. La selección positiva de timocitos CD4+CD8 con RLT αβ precisa el reconocimiento con avidez baja de los complejos péptido-CPH sobre las células epiteliales tímicas, lo que lleva al rescate de las células de la muerte programada. La selección negativa de los timocitos dobles CD4+CD8 con RLT αβ se produce cuando estas células reconocen, con avidez elevada, antígenos que están presentes en el timo. Este proceso es responsable de la tolerancia a muchos autoantígenos. La mayor parte de los timocitos corticales no sobrevive a estos procesos de selección. A medida que maduran los timocitos que expresan RLT αβ, se desplazan hacia la médula y se convierten en linfocitos CD4+CD8- o CD8+CD4-. Los timocitos medulares adquieren la capacidad de diferenciarse en linfocitos efectores cooperadores o citotóxicos y finalmente migran hacia los tejidos linfáticos periféricos.

ESTADIOS EN LA MADURACIÓN DEL LINFOCITO T Dos tipos de moléculas producidas por las células tímicas no linfocíticas son importantes para la maduración de los linfocitos T. El primero son las moléculas del CDP de la clase I y de la clase II, que se expresan en las células epiteliales y las células dendríticas del timo. La maduración de los linfocitos T en el timo también progresa en fases que se distinguen por la expresión de los genes del receptor del antígeno, las moléculas correceptoras CD4 y CD8, y su localización en el timo. Los inmigrantes del linaje T más tempranos que llegan al timo no expresan RLT ni moléculas CD4 ni CD8. Los linfocitos T en desarrollo en el interior del timo, denominados timocitos, pueblan inicialmente la corteza externa, donde experimentan proliferación, reorganización de los genes del RLT y expresión en la superficie de moléculas de CD3, RLT, CD4 y CD8. A medida que las células maduran, migran desde la corteza hasta la médula.

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