MADURACIÓN LINFOCITARIA Y EXPRESIÓN DE GENES DE LOS RECEPTORES ANTIGÉNICOS Dr. Manzur Hassanhi MADURACIÓN, ACTIVACIÓN Y REGULACIÓN LINFOCITOS I.

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1 MADURACIÓN LINFOCITARIA Y EXPRESIÓN DE GENES DE LOS RECEPTORES ANTIGÉNICOS Dr. Manzur Hassanhi MADURACIÓN, ACTIVACIÓN Y REGULACIÓN LINFOCITOS I

2 Introducción Linfocitos  receptores antigénicos altamente diversos Diversidad generada durante la maduración de linfocitos desde células precursoras Células precursoras no expresan receptores antigénicos y no pueden reconocer Ags Colección de diferentes receptores antigénicos  repertorio linfocitario

3 Introducción Maduración linfocitos  expresión génica secuencial lleva a: Proliferación de las células en desarrollo Generación de un repertorio linfocitario diverso Cambios fenotípicos Adquisición de competencia funcional Procesos de selección  tolerancia a lo propio

4 Características generales de la maduración linfocitaria Etapas secuenciales Maduración temprana  compromiso con linaje linfoide y proliferación Células troncales Expresión genes de receptores linfocitarios Selección repertorios linfocitarios maduros En cada etapa las células sufren cambios genéticos y fenotípicos

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6 Recombinación genes y expresión de receptores antigénicos Expresión receptor antigénico  evento central en la maduración linfocitaria Generación diversidad Necesario para procesos de selección Cada clon linfocitos expresa R antigénico con estructura de unión a antígenos única ≥10 7 clones LB y T diferentes Capacidad de generar repertorio diverso no requiere una cantidad igual de genes diferentes Recombinación

7 Recombinación genes y expresión de receptores antigénicos R antigénicos envían señales a linfocitos en desarrollo necesarias para su sobrevida y maduración Ausencia expresión R antigénico  apoptosis linfocito Asegura producción solamente de linfocitos útiles, con receptores antigénicos funcionales Procesos de selección  repertorios linfocitarios Expresión de receptores antigénicos por linfocitos inmaduros Eliminación de linfocitos potencialmente autorreactivos

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9 Adquisición de competencia funcional En etapas tardías de maduración  linfocitos adquieren capacidad de responder a Ags y generar mecanismos efectores para eliminarlos Maduración funcional involucra expresión de diferentes moléculas de superficie e intracelulares que participan en la activación y funciones efectoras de linfocitos

10 Recombinación genes receptores antigénicos Genes de receptores antigénicos  formados por secuencias separadas espacialmente que deben unirse para producir genes funcionales que codifiquen los receptores antigénicos Organización de línea germinal  todas las células del organismo Genes funcionales de receptores antigénicos se crean sólo en linfocitos en desarrollo  reordenamientos DNA

11 Loci inmunoglobulinas (BCR) 3 loci codifican cadenas pesadas,  Múltiples copias de 3 – 4 tipos de segmentos génicos Cadena liviana  V + J, C Cadena pesada  V + D + J, C Grupos de segmentos génicos separados por DNA no codificante

12 Segmento Cadenas livianasCadenas pesadas  H Variable (V)403065 Diversidad (D)0027 Unión (J)546

13 Organización loci TCR 3 loci diferentes   Cada locus múltiples copias segmentos Cadena a y g  V + J, C Cadena  y   V + D + J, C

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16 Recombinación genes de receptores antigénicos Acercamiento de segmentos génicos Corte DNA extremos segmentos génicos Unión  genes que pueden transcribir Proceso mediado por enzimas “Recombinasa V(D)J” Durante recombinación V(D)J se añaden/remueven nucleótidos desde las uniones  nucleótidos N y P Este proceso genera diversidad

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19 Generación de diversidad de repertorios linfocitarios Diversidad de combinación Recombinaciones  combinaciones al azar Nº genes V x J (x D) en cada locus Aumenta diversidad al combinar regiones V Ig (V L + V H ), TCR (V  + V  ) Diversidad real es menor que la teórica Diversidad de la unión  principal contribuyente a la diversidad Remoción / adición de nucleótidos en las uniones de segmentos génicos  nucleótidos P y N

20 Maduración de linfocitos B Eventos principales Reordenamiento y expresión de genes Ig Proliferación de linfocitos B inmaduros Selección de un repertorio linfocitario maduro Maduración linfocitos B  MO Hígado fetal Etapas de maduración caracterizadas por Patrón de expresión de genes Ig Moléculas de superficie  marcadores fenotípicos del estadio de maduración

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23 Exclusión alélica Cada LB puede expresar cadenas pesadas codificadas por 1 cromosoma Expresión exitosa de cadena  con formación de receptor pre-B  inhibe el reordenamiento de locus cadena pesada en el otro cromosoma 1 er reordenamiento fallido  reordenamiento de locus cadena pesada del otro cromosoma Falla en ambos locus  apoptosis (frecuente) Asegura que el clon de linfocitos B tenga 1 sola especificidad

24 Exclusión alélica  cada linfocito de animal heterocigoto expresa un solo tipo de Ig, a pesar de heredar genes para 2 tipos de Ig

25 Célula B inmadura Reordenamiento cadena liviana  o Locus cadena  se reordena primero  reordenamiento sólo en caso falla  “Exclusión de cadena liviana” También existe exclusión alélica Cadena L  asociación con cadena pesada  IgM de membrana  linfocito no funcional Ags propios en médula ósea  muerte o anergia

26 Célula B madura Coexpresión de IgM e IgD de membrana Cadenas pesadas  o  unidas a la cadena liviana reordenada Tienen la misma región V  igual especificidad antigénica Adquisición de competencia funcional Presentes en circulación y órganos linfoides periféricos

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28 Selección de repertorio maduros de linfocitos B Procesos de selección  LB inmaduros Selección positiva en MO  no bien definida LB con BCR funcional pueden completar maduración? Selección negativa  LB inmaduros que expresan BCR que reconoce Ags propios con alta afinidad  apoptosis (Autotolerancia) Edición del receptor” Reconocimiento Ags lleva a reactivación enzimas de recombinación  nueva recombinación VJ en cadena liviana

29 Linfocitos B-1 Subpoblación linfocitos B  5 – 10% linfocitos B en circulación y órganos linfoides Expresión molécula CD5 Receptores antigénicos de diversidad limitada Producción de anticuerpos naturales IgM producida espontáneamente Reconoce polisacáridos microbianos y algunos autoAgs 1ª línea de defensa contra Ags microbianos comunes?? Leucemias linfocíticas crónicas  la mayor parte deriva de linfocitos B CD5 +

30 Maduración de linfocitos T Etapas Recombinación somática y expresión genes TCR Proliferación celular Selección inducida por antígeno Adquisición de fenotipo maduro y capacidad funcional Proceso similar al de linfocitos B

31 Rol del timo en maduración linfocitos T Principal sitio maduración LT  timocitos Timo involuciona con la edad  remanente?? Sitios extratímicos de maduración?? Timocitos más inmaduros TCR-, CD4-, CD8- Timocitos maduros migran desde la corteza a la médula del timo  salen a la circulación 95% células mueren por apoptosis

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36 Estimula proliferación células pre-T Estimula recombinación cadena  del TCR Estimula paso de célula “doble negativa” a “doble positiva” Exclusión alélica cadena  No existe exclusión alélica en cadena   puede haber reordenamientos en ambos cromosomas Hasta 30% LT maduros expresan 2 tipos de TCR  2 cadenas  + un tipo de cadena  Receptor de célula pre-T

37 Timocitos “doble positivo” Selección estimulada por reconocimiento antígenos en el timo Responsables de preservación linfocitos útiles y eliminación de células potencialmente peligrosas Repertorio inmaduro de linfocitos T Reconocen cualquier Ag peptídico (propio o extraño) presentado por cualquier molécula MHC (propia o extraña) Algunas células no reconocen ningún tipo de MHC Procesos de selección

38 Linfocitos T útiles deben reconocer Ags extraños presentados por MHC propio Linfocitos T que reconocen Ags propios con alta avidez son potencialmente peligrosos  pueden gatillar autoinmunidad Timocitos doble positivo expresan TCR   reconocen péptidos propios presentados por moléculas MHC propias en el timo No existen péptidos antigénicos ni moléculas MHC extrañas en el timo

39 Selección positiva Timocitos con TCR que se unen débilmente a complejos MHC propio – péptido propio son estimulados para sobrevivir TCR que no reconoce MHC propio  apoptosis Asegura repertorio restringido por MHC propio Determina restricción MHC I ó II

40 Selección negativa Timocitos con TCR que se une fuertemente a Ags peptídicos propios asociados a MHC  deleción por apoptosis Elimina LT autorreactivos contra Ags propios ubicuos Asegura LT tolerantes a la gran mayoría de los Ags propios “Tolerancia central”

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42 Linfocitos T  Linaje diferente a linfocitos T  Precursor común Diversidad teórica del TCR  es mayor que la del TCR  Diversidad real es limitada  uso de sólo algunos segmentos V, D y J

43 ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T Dr. Manzur Hassanhi MADURACIÓN, ACTIVACIÓN Y REGULACIÓN LINFOCITOS II

44 Introducción Fases de activación y efectora de la respuesta inmune adaptativa celular  gatilladas por reconocimiento antígenos por linfocitos T Unión complejo MHC – péptido a TCR  expansión y diferenciación linfocitos T, funciones efectoras de linfocitos T Subpoblaciones linfocitos T  requerimientos de activación y patrones de activación diferentes

45 Características generales de la activación linfocitos T LT naive reconocen Ags y son activados en órganos linfoides periféricos  expansión pool LT específicos de Ag, diferenciación en linfocitos efectores y de memoria Ags proteicos que penetran por epitelios  captados por APC profesionales y transportados a ganglios y bazo LT efectores reconocen antígenos en órganos linfoides periféricos o en tejidos periféricos no linfoides  activación Migran a cualquier sitio de inflamación o infección

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48 Características generales de la activación linfocitos T Activación de linfocitos T requiere Reconocimiento del Ag presentado por APC Coestimuladores Citoquinas producidas por APC o LT Estímulos actúan en conjunto para inducir las fases secuenciales de las respuestas de LT Activación inicial Proliferación Diferenciación

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51 Características generales de la activación linfocitos T Reconocimiento MHC – péptido por TCR  1ª señal de activación Especificidad de la respuesta Participación moléculas accesorias Correceptores CD4/CD8  reconocimiento moléculas MHC II/I, transducción de señales de activación Moléculas adhesión  estabilizan unión LT – APC Receptores coestimuladores Citoquinas

52 Características generales de la activación linfocitos T Linfocitos T naive  activados por células dendríticas Linfocitos T efectores  activados por diferentes APC Macrófagos, linfocitos B Menor dependencia de coestimuladores

53 Respuestas funcionales de linfocitos T Respuestas de linfocitos T al reconocimiento antigénico Secreción de citoquinas Proliferación Diferenciación

54 Secreción de citoquinas Precoz Señales derivadas de Ag y coestimuladores estimulan síntesis citoquinas IL-2  principal citoquina LT naive Factor de crecimiento para linfocitos T Diferenciación LT naive en subpoblaciones que secretan diferentes tipos de citoquinas Mejor definidas  LT CD4 + T H 1 y T H 2 También aumenta síntesis de receptores citoquinas

55 Proliferación Mediada principalmente por un mecanismo autocrino Linfocito T que reconoce Ag secreta citoquinas que estimulan su propio crecimiento Receptores de citoquinas Principal factor de crecimiento autocrino  IL-2 Proliferación linfocitos T naive  expansión clonal

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57 Proliferación Antes de reconocimiento Ag  frecuencia linfocitos T naive específicos para un Ag determinado ~ 1 / 10 5 – 10 6 linfocitos Después de reconocimiento Ag Linfocitos T CD8 +   a 1/10 Linfocitos T CD4 +   a 1/100 -1000 Número linfocitos  rápidamente después de eliminación del Ag Linfocitos de memoria sobrevivientes  1/10 4 células

58 Diferenciación en células efectoras Algunas células de la progenie linfocitaria se diferencian en linfocitos efectores  eliminación del Ag Activación de otras células Proceso dependiente de Reconocimiento Ag Otros estímulos  coestimuladores y citoquinas producidas en el sitio de reconocimiento Ag

59 Diferenciación en células efectoras Progenie linfocitos T CD4 + estimulados por Ag se diferencia en células que activan macrófagos y linfocitos B Subpoblaciones  T H 1, T H 2 Progenie de linfocitos T CD8 +  eliminación de células blanco que expresan complejos MHC – péptido reconocidos por CTL

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61 Diferenciación en células de memoria Algunas células de la progenie de linfocitos T estimulados se diferencia en células de larga duración y funcionalmente inactivas  células de memoria Sobreviven por largos períodos después de la eliminación del Ag Responsables de la respuesta inmune 2ª frente a exposiciones subsecuentes al mismo antígeno

62 Diferenciación en células de memoria No se conocen los mecanismos de generación y sobrevida de las células de memoria Diferenciación a partir de linfocitos efectores o linfocitos estimulados por Ag?? Sobrevida de células de memoria no requiere reconocimiento de Ags Acumulación a lo largo de la vida Recién nacido  casi todos los linfocitos son naive Adulto  ≥ linfocitos son células de memoria

63 Diferenciación en células de memoria Células de memoria son capaces de migrar rápidamente a sitios periféricos de infección o inflamación  retenidas Altos niveles de integrinas y CD44 No tienen actividad funcional hasta ser expuestas nuevamente al Ag Rápida proliferación  función efectora

64 Declinación de las respuestas de linfocitos T Respuesta de linfocitos T declina rápidamente después de la eliminación del Ag Restauración del estado de reposo del sistema inmune  “homeostasis” Mayor parte de los linfocitos T activados por Ag muere por apoptosis Supresión de estímulos de sobrevida aportados por Ag Supresión de citoquinas producidas durante la inflamación

65 Rol coestimuladores en activación de linfocitos T Proliferación y diferenciación de LT requiere moléculas producidas por APC junto a las señales inducidas por el reconocimiento Ag “Coestimuladores” 1ª señal de activación  unión Ag a TCR Complejos MHC – péptido 2ª señal de activación  coestimuladores Ausencia coestimulación  apoptosis o anergia

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69 Rol coestimuladores en activación linfocitos T Vía de coestimulación mejor caracterizada  CD28 – B7 CD28  molécula de superficie linfocito T B7-1, B7-2  expresadas en APC activadas Esencial en activación LT CD28 transmite señales que estimulan muchas respuestas de linfocitos T Sobrevida linfocitos Producción de citoquinas  IL-2 Diferenciación LT naive en células efectoras y de memoria

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71 Rol coestimuladores en activación linfocitos T Linfocitos T activados expresan CD40L  unión a CD40 expresado en APCs Señales que aumentan expresión B7 Reconocimiento Ag por linfocitos B  estimulación expresión B7 LB estimulados por Ag son capaces de activar a LT y recibir colaboración de LT helper Células dendríticas maduras expresan los mayores niveles de coestimuladores  estimuladores más potentes de LT naive

72 Rol coestimuladores en activación linfocitos T Ausencia de coestimuladores en APCs no estimuladas  mantención tolerancia Presentan Ags propios a linfocitos T LT potencialmente autorreactivos  no activados, anérgicos LT efectores previamente activados y de memoria  menos dependientes de coestimulación CD28-B7 que los naive Pueden responder a Ags presentados por varios tipos de APCs residentes en tejidos no linfoides con baja o nula expresión B7

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74 Transducción de señales por TCR complex Objetivo vías de señalización de linfocitos T  activar transcripción de genes silentes en linfocitos T naive Productos median respuestas y funciones de linfocitos T activados Reconocimiento Ag por TCR inicia una secuencia de señales bioquímicas  activación transcripción de algunos genes y entrada en ciclo celular TCR no tiene capacidad de señalización  asociado a proteínas que pueden unir enzimas y moléculas adaptadoras

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76 Transducción de señales por TCR complex Señales del complejo de señalización de membrana activan varias vías bioquímicas importantes Activación vías enzimáticas en minutos Vías enzimáticas inducen activación de factores de transcripción  estimulación expresión génica Horas Existen 3 FT críticos para respuestas de linfocitos T  NFAT, AP-1, NF  B Activación linfocitos T

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