CORRELACIÓN DEL ESTADO DE METILACIÓN EN TUMOR Y SUERO DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS Y FENOTIPO LUMINAL EN PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA J. Martínez Galán1, R. Del Moral Ávila2, G. Durán Ogalla3, V. Gutiérrez Calderón3, B. Torres Torres4, , M.I. Núñez Torres4, I. Alés Díaz3, J. López Peñalver4, M. Benavides Orgaz3, M. Ruiz de Almodóvar4 1Servicio de Oncología Médica. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. 2Servicio de Oncología Radioterápica. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. 3Servicio de Oncología Médica. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga. 4Centro de Investigaciones Biomédicas. Universidad de Granada.

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS: La metilación es un evento epigenético que ocurre en la célula de forma fisiológica en la célula sana y que tiene un papel decisivo en la regulación de los procesos de transducción de señales y en el mantenimiento de la integridad del genoma (niveles apropiados de ADN metilado ) (Nakagawa,T. et al. 2005) Éste hecho que sucede de forma fisiológica y que tiene un papel fundamental a la hora de dictaminar qué genes se activarán durante el proceso de diferenciación de la célula comprometida, también puede mediar cuando se produce de forma aberrante en el desarrollo de un proceso tumoral. La metilación de las CpG island de la región promotora del gen es un mecanismo principal para inactivación en etapas tempranas de la carcinogénesis de genes de supresor de tumor favoreciendo el desarrollo y la progresión del tumoral.( Herman J.G. 2003. Baylin 2006). OBJETIVOS: Diferencias en el patrón de metilación en un panel de 5 genes; Casos/ Control. Analizar correlación: Perfil de metilación/ factores clínico-patológicas y factores pronósticos habitualmente empleados en clínica. Metilación RE (+) y Fenotipo Luminal. ya que pocos estudios han correlacionado los cambios epigenéticos con las caracteristicas clinicopato y fenotipo luminal ayudasen a profundizar en el conocimiento molecular y cascadas de transducción de señales que median en los procesos de proliferación y supervivencia celular) Supusimos que tumores de mama ERPOSITIVE tienen los perfiles diferentes epigenetic de genes relacionados con el tumor durante las tempranas etapas de progresión de cáncer

MATERIAL Y METODOS: Se realizó un estudio prospectivo 2001-2005; N= 107 grupo casos (pacientes con cáncer de mama no pretratadas) N= 110 grupo control (sin antecedentes familiares cáncer) Extracciones: 1 muestra de sangre periférica previa al tratamiento oncológico. PCR Real Time: RAR-B, RE, 14-3-3 Sigma, APC y E-Cadherina: Extracción y cuantificación ADN (Kit QIAamp® DNA Blood Midi/Maxi (Cat. nº51185) Modificación bisulfítica del DNA metilado (CpGenome TM Modification Kit (Cat. nº S7820) Amplificación por PCR Tiempo Real (iQTM SYBR® Green Supermix) En tumor: Expresión RE. RP. Her2. Primers Sense/ antisense E- Cadher. 5’-GCGTTTGGTCGCGGAGTTC 5’TTCCCTCAAAAATCGTCCCCAC 14.3.3 Sigma 5´TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC 5’-CCTCTAACCGCCCACCACG RAR-B 5’-GAACGCGAGCGATTCGAGT 5’-GACCAATCCAACCGAAACG APC 5’-TATTGCGGAGTGCGGGTC 5’-TCGACGAACTCCCGACGA RE 5´GATACGGTTTGTATTTTGTTCGC 5’CGAACGATTCAAAAACTCCAACT

Histológicas del Grupo RESULTADOS: Características Biográficas del Grupo Casos/ Control Casos Control Media S* Edad Media 58 años (32-88) 12.4 43años (18-59) 13.5 Edad Menarquia 13 años (10-14) 1.4 12 años (9-13) 1.6 Edad Menopausia 46 años (39-49) 3.8 45 años (30-49) 3 Edad Primer Embarazo 25 años (18-41) 3.9 25 años (18-38) 4.1 Edad Último Embarazo 32 años (20-42) 5.2 20 años (30-44) 5.3 Lactancia Materna 5.8 meses (1-36) 5.1 4.8 meses (1-24) 4.7 Características Histológicas del Grupo Casos Estado Menopáusico Premenopáusica Postmenopáusica 33 pts (30%) 74 pts (69%) Histología C. Ductal Infilt. C. Lobulillar Infil. 72 pts (67%) 20 pts (19%) Estadio T: T1 T2 T3 T4 62 ( 58%) 38 ( 35%) 3 ( 4%) 4 ( 4%) Estadio N: N0 N1 N2 68 (63%) 32 (30%) 7 ( 7%) G. Diferenciación: GI GII GIII 20 (18.7%) 40 (37.4%) 35 (32.7%) R. Hormonales: Si No 70% 20% Estado HER2: (+) (- ) 18%

Niveles de Significación exactos test de Kruskal-Wallis RESULTADOS: Objetivo 1. Niveles de Significación exactos test de Kruskal-Wallis Promotores Significación P RE 0.0007 E- Cadher. P> 0.05 RAR-B APC 14.3.3 Sigma 0.0064 RE o 14-3-3 Sigma Cáncer mama Controles Enfermedad (+) +/- -/+ +/+ 87 33 +/+ 39 9 Enfermedad (-) -/- 20 41 +/- -/+ -/- 67 65 P < 0.0001 P = 0.0003 Sensibilidad = 81% (95% IC: 72-88) Sensibilidad = 37% (95% IC: 73-47) Especificidad = 55% (95% IC: 40-67) Especificidad = 88% (95% IC: 78-94)

RE METILADO EN SUERO RE (-) Tumor p < 0.0179 RESULTADOS: Objetivo 2. Factores Clínico-Patológicos RE (+) (-) APC E-CADH RAR-B (+) (-) 14-3-3 SIGMA (+) (-) E. Diagnóstico ≤ 35 años > 35 años P 54 2 49 NS 3 56 1 47 43 60 40 63 62 41 E. Menarquia <12 años ≥13 años 29 26 24 27 33 20 21 32 22 19 31 34 30 23 E. Menopausia <45 años ≥45 años 35 37 36 42 46 39 Estado Menopáusico Premenop. Postmenop. 12 10 38 0.07 14 15 18 48 9 G. Diferenciac. GI GII- III 11 13 8 Estadio T T1 T2 T3-4 4 16 25 5 7 <0.05 E. Ganglionar N0 N1 N2 17 28 Metástasis M0 M1 51 52 6 57 RE METILADO EN SUERO RE (-) Tumor p < 0.0179 > 70%

RESULTADOS: Objetivo 2. % Metilación RE RE LUMINAL A B TRIPLE NEGATIV HER2 P NO METILADO 28 (71%) 13 (40.6%) 3 (20%) 4 (40%) < 0.05 METILADO 11 (28%) 19 (5.9%) 12 (80%) 6 (60%) Fenotipo Nº SLE 4.5 años SG 4.5 años p LUMINAL A 39 87% 90% <0.05 LUMINAL B 32 85% 89% >0.05 TRIPLE NEGATIVO 15 60% 80% Her2 10 65% 75% Nº SG 4.5 años p RE NO MET luminal A 28 93% >0.05 luminal B 13 92% TRIPLE NEGATIVO 3 80% Her2 4 75,0% RE MET 11 81,8% 19 86% 12 75% 6 66,7%

CONCLUSIONES: Parecen existir un patrón de metilación diferente entre las pacientes con cáncer de mama y población sana. Este patrón aberrante de metilación podría tener un papel complementario en el diagnóstico precoz del cáncer de mama. El silenciamiento génico por metilación, parece asociarse a tumores con peor pronóstico; mayor tamaño tumoral, afectación nodal y subtipos moleculares de peor pronóstico. Cuestiones a analizar; La metilación podría estar relacionada con el mecanismo de resistencia del tratamiento hormonal? La metilación es un proceso reversible, podría tener aplicación clínica?