CINÉTICA ENZIMÁTICA Estudia la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente Los principios generales de las reacciones químicas se aplican también a las reacciones enzimáticas

Definición de la velocidad de reacción V= -d[S] = d[P] dt dt

Conceptos básicos de cinética química Las reacciones químicas se clasifican en: Monomoleculares, bimoleculares y trimoleculares según el número de reaccionantes sea uno, dos o tres. A  P A+B  P A+B+C  P Las reacciones químicas también se clasifican en: reacciones de orden cero, primer orden, segundo orden y tercer orden dependiendo de cómo la velocidad de reacción es influenciada por la concentración de los reaccionantes. V = -d[S] = d[P] dt dt

Conceptos básicos de cinética química En una reacción de orden cero, la velocidad de formación del producto es independiente de la concentración de sustrato: v = k En una reacción de primer orden la velocidad de formación de los productos es directamente proporcional a la concentración del sustrato: v = k [A] Una reacción de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formación del producto depende  de la concentración de dos sustratos (como en una reacción de condensación): v = k [A 1 ] [A 2 ]  del cuadrado de la concentración de un único sustrato (reacción de dimerización): v = k [A] 2

Factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática 1.Concentración de Enzima 2.Concentración de sustrato 3.pH 4.Temperatura

Factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática 1. Concentración de Enzima

2. Concentración de sustrato

Modelo Cinético de Michaelis - Menten

M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema : Sacarosa Glucosa + Fructosa Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones experimentales a)(E) variable y (S) constante b)(E) constante y (S) variable invertasa agua

KMKM = Constante de Michaelis -Menten Constante global que sustituye o engloba las constantes de velocidad de la reacción de interacción entre el enzima y el sustrato Vo = Velocidad inicial de reacción Vmax = Cuando el enzima se halla saturada Se supone: E + S ES ES E + P

La derivación de la ecuación se basa en: 1) que la concentración de S es mayor que la concentración de E 2) La concentración de Producto al inicio de la reacción es insignificante 3) el paso limitante de la velocidad es la transformación de ES a E+P

En equilibrio rápido: En estado estacionario:

s s

Ecuación de la velocidad de una reacción enzimática

DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL Se tiene: vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S] Km + [S] vo Vmax*[S] Se factoriza 1 = Km * 1 + [S] vo Vmax [S] Vmax[S] Se simplifica: 1 = Km * vo Vmax [S] Vmax La ecuación de la recta es: y = a * x + b

La ecuación de la recta es: y = a * x + b donde: y = 1 y x = 1 Vo [S] El valor de Km puede ser hallado a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco usando la pendiente y la intersección negativa de x.

¿Por qué determinar Km? K m es una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato cuando k 3 <k 2. K m= (k 2+ k 3 )/k 1 K m establece un valor aprox. para el valor intracelular de sustrato K m es constante para una enzima dada, permite comparar enzimas de diferentes organismos o tejidos o entre distintas proteínas Un cambio en el valor de K m es un modo de regular la enzima

3. pH del medio

3. Efecto del pH del medio El sitio activo de la enzima esta frecuentemente compuesto de grupos ionizables que deben estar en la forma iónica adecuada para mantener la conformación, unir los sustratos o catalizar la reacción. La actividad de la enzima debe ser medida al pH óptimo

4. Efecto de la Temperatura

4. Temperatura A medida que aumenta la temperatura por lo general aumenta la actividad catalitica dentro del margen de estabilidad de la enzima

INHIBICION ENZIMATICA ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER- BURKE EN LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.

INHIBIDORES 1.Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos: E + I EI 2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima: E + I E’ ES + I ESI

INHIBICIÓN REVERSIBLE (a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, IMPIDIENDO LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO: Inhibición Competitiva (b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, NO IMPIDE LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

EES EI I S E + P Características: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato. - El inhibidor es tan específico como el substrato Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor: K i = [E] [I] [EI] Inhibición Competitiva

Por tanto, en la inhibición competitiva, 1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la K m, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/K i ) 2. La V max no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = V max, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto más pequeño sea el valor de K i mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

-1/K m -1/(K m (1 + i/K i )) 1/V max Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

Succinato deshidrogenasa Inhibidores competitivos

Inhibidores competitivos como ánalogos estructurales del substrato

EES EI I S E + P I ESI S Inhibición No Competitiva El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

INHIBICION NO COMPETITIVA E + I EI I + ES ESI

El agente quelante EDTA se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de modo no competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para su actividad.

DROGAUSO TERAPEUTICO ENZIMA AFECTADA TIPO DE INHIBICION LovastinaHipercolestero lemia HMGCoA reductasa Competitiva 5fluoroacilcancerDihidrofolato reductasa competitiva alopurinolgotaXantino oxidasa irreversible cumadinanticoagulanteGlutamilcar boxilasa competitiva captoprilhipertensiónECAcompetitiva

concepto de Análogo de Estado de Transición (AET) - El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato, sino del Estado de Transición de la reacción. - La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que puede considerarse irreversible

Substrato Estado de transición Análogo de estado de transición

EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN LAS INTERACCIONES ENTRE LA ENZIMA Y EL SUSTRATO SON ÓPTIMAS

INHIBICIÓN IRREVERSIBLE - Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente E + IE’ -El efecto de los inhibidores irreversibles depende del -tiempo de actuación del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfóricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, (a) Agentes alquilantes Yodoacetato (b) Compuestos insaturados N-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2 (c) Formadores de mercáptidos p-Hidroximercuribenzoato (d) Oxidantes Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos DFP: diisopropil fluorofosfato - Actúan sobre enzimas serínicas - Únicamente sobre la Ser activa - Insecticidas: Parathion, Malathion - Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

Ligandos de coordinación de metales Es el caso del ion cianuro, CN - Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior. Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad