*Rodríguez A., *Sicardi M., **Curbelo, S.; **Pastorini, D. y *Frioni L Habilidad competitiva y persistencia de rizobios aislados de praderas de tréboles con varios años de instaladas  *Rodríguez A., *Sicardi M., **Curbelo, S.; **Pastorini, D. y *Frioni L *Facultad de Agronomía, Departamento de Biología Vegetal, Laboratorio de Microbiología. Av. Garzón 780, E- mail: andrearb@fagro.edu.uy ** Facultad de Ciencias, Centro de Investigaciones Nucleares, Laboratorio de Microbiología de Suelos, de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.  INTRODUCCIÓN Entre las leguminosas introducidas más empleadas en Uruguay se encuentran trébol blanco (Trifolium repens), trébol rojo (Trifolium pratense) y varias especies de Lotus. Es frecuente la baja persistencia de los tréboles, los cuales empiezan a desaparecer del tapiz a partir del tercer año. Esto se ha explicado por la presencia de una población de rizobios nativa, relacionada con la presencia de Trifolium polimorphum, una leguminosa nativa, poco productiva que establece una asociación del tipo inefectiva con estos tréboles. Muy poco se sabe sobre el comportamiento en campo de las cepas utilizadas en los inoculantes comerciales en años sucesivos a la inoculación. El objetivo de este trabajo es determinar la capacidad simbiótica de las poblaciones de rizobios asociadas a trébol blanco y trébol rojo en praderas de 1 y 3 años y estudiar la habilidad competitiva y la persistencia de la cepa utilizada en la inoculación por técnicas de biología molecular. MATERIALES Y MÉTODOS Zona de muestreo y Aislamiento de rizobios Las praderas artificiales compuestas de trébol blanco, trébol rojo y festuca se instalaron en el departamento de Maldonado, al este del país y fueron inoculadas con el inoculante comercial recomendado.Se muestrearon plantas noduladas y suelo de praderas de 1 y 3 años. Los aislamientos de rizobios provinieron de: inoculantes comerciales, nódulos de tréboles de ambas praderas y del suelo luego de inoculado en plántulas en solario. Se incluyó en el trabajo la cepa de referencia USDA 2152 (Rhizobium leguminosarum bv trifolii, proveniente de USA) y la cepa U-204 ( CIAT 2455 Rhizobium leguminosarum bv trifolii), utilizada en el país para la fabricación del inoculante. Eficiencia simbiótica Se evaluó inoculando plántulas de tréboles con diluciones de suelo de las praderas y de campo natural adyacente a las mismas y con rizobios aislados. A los 60 días se midió la biomasa aérea seca y se contrastó con testigos. Caracterización de los aislamientos Técnicas: perfil de plásmidos y MLEE (multilocus enzyme electrophoresis o electroferotipos) para algunos aislamientos. RESULTADOS Foto 2: gel de agarosa 0.7 % donde se observan los perfiles plasmídicos de algunos de los aislamientos. USDA 2152 U 204 Aislamientos: se obtuvieron un total de 70 Perfil de plásmidos Se obtuvieron perfiles plasmídicos de la mayoría de los aislamientos analizados. Se encontraron 11 perfiles distintos (foto 2 y esquema). Eficiencia simbiótica varió entre los aislamientos de pradera de 1 y de 3 años; algunos presentaron valores estadísticamente más altos que los de U-204, que a su vez no difirió del tratamiento fertilizado con N. Otros aislamientos mostraron una eficiencia simbiótica muy baja (foto 1). Se observó disminución de la biomasa vegetal en los tratamientos inoculados con suelo de pradera de 3 años y alta eficiencia en los inoculados con campo natural (gráfico 1). Foto 1- Ensayo de eficiencia simbiótica donde se observan las diferencias entre las plantas inoculadas con las distintas cepas. Tabla 1: Perfiles plasmídicos de los aislamientos asociados a tréboles. 126 XI 86 X 77, 111, 112 IX 72 VIII 120, 121 VII 66 VI 62, 65 V 56 IV 54, 55 III 67, 70, 74, 76, 51, 105, 109, 136 II 1, 2, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 73, 75, 78, 81, 82, 83, 129, 131 117, 118, 119, 134 I Aislamientos Perfil Pradera 1 año (P1) Pradera 3 años (P3) Plantas inoculadas con suelo de P1 U 204 Inoculantes Plantas inoculadas con suelo de P3 Esquema de los perfiles plasmídicos encontrados entre los aislamientos. 2 4 6 8 10 12 biomasa aérea seca (mg/pl.) baja alta alta diluciones de suelo Trifolium repens Trifolium pratense Pradera 1er año Pradera 3er año Campo natural 1er año Campo natural 3er año Gráfico 1: eficiencia simbiótica de plantas de T. repens y T. pratense inoculadas con suelo de praderas de 1 y 3 años y campo natural. USDA 2152 U 204 I II IX X III IV VII XI V VI VIII CONCLUSIONES Se observó una reducción significativa en la eficiencia simbiótica de las poblaciones de rizobios asociadas a trébol blanco y trébol rojo entre el primer y el tercer año de instalación de la pradera. El perfil plasmídico demostró diversidad entre los aislamientos y permitió reconocer la cepa utilizada en la inoculación entre los aislamientos de nódulos de praderas de 1 y 3 años. Se continúa trabajando en determinaciones de electroferotipos y/o ribotipos a los efectos de confirmar estos resultados preliminares. Las diferencias en el perfil plasmídico de los aislamientos (tabla 1) puede deberse a la presencia de diferentes cepas de la misma especie del rizobio del inoculante o especies diferentes. Hipótesis que serán confirmadas mediante otras técnicas moleculares que permiten identificar las cepas. MLEE La cepa U-204 y 3 aislamientos con igual perfil plasmídico a ésta (73, 129 y 117) mostraron iguales electroferotipos. Financiamiento: PEDECIBA (Programa de Desarrollo de las Ciencias Básicas) y CSIC (Comisión Sectorial de Investigación Científica) que permitió realizar una pasantía en el Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno de Cuernavaca, México.