Transferencia de material genético Aislamiento de plásmidos
Conformaciones de un plásmido Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado
Superenrollamiento del DNA plasmídico
Factores que afectan la estructura del DNA Calor pH Concentración de iones
Temperatura de fusión: Tm Temperatura a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.
Método de purificación G= Glucosa (evitar stress) T=Tris (Amortiguador) E= EDTA (Quelante de Mg)
Determinación de concentración de DNA
Pureza del DNA Determinación de pureza A260/A280 Relación de 1.9-2.0 alta pureza Determinación de contaminantes de DNA Absorbancia a 230 contaminación por fenol o urea
Enzimas de restricción Tipo I Una sola enzima que posee 3 subunidades reconoce el sitio de ADN Esta enzima metila y restringe. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento. Tipo II Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos.
Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora. Pueden generar dos tipos de cortes
Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda)
Mapa de restricción
A PCR-amplified DNA fragment has been digested with three different restriction endonucleases (EcoRI, Bgl II, & MboI), singly (lanes 1-3) and in pairwise combination (lanes 4-6). Comparison with a molecular weight standard (lane 7) allows a determination of the sizes of the fragments in the digests, which in turn permit an inference of the order and distances among restriction sites in the DNA fragment