Proteína recombinante β-Lactamasa

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

cDNA

Inducción a las proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento (80%) ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria..... Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-traduccionales Incompatibilidad de codones .... depende de la complejidad de la proteína

Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli) Ajuste de condiciones Vector híbrido o recombinante

OPERON LAC

Vector de clonación pET-24a(+)

Selección de bacterias transformadas

Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción

El sistema de expresión también debe tener las siguientes características en su genoma: Cromosoma de Escherichia coli

El vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene

Análogos de la lactosa

Diferencias entre DH5alfa y BL21(DE3) DH5 alfa: tiene al gen recA mutado, no puede realizar recombinación heteróloga (asegura la estabilidad del inserto). Carece de algunas endonucleasas, impidiendo la digestión del plásmido. Esta cepa es competente para la selección de colonias azules y blancas. BL21. Deficiente en algunas proteasas, degrada menos a las proteínas recombinantes. Emplea a la RNA polimerasa T7 (cepa DE3) que se induce con IPTG.

Problemas…

BL21

Inducción

Procedimiento Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB (17.5 mL) Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD600 0.6-0.8 Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 0.5 ó 1 mM (final) Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Después de cada toma centrifugar y guardar sobrenadante (!!!) Tomar 18 µL y mezclar con 12 µL de BC, desnaturalizar (5 min a 95 ͦ C). Correr en SDS-PAGE.

Peculiaridades de la construcción: En vector pET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA: Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis

Purificación de la proteína recombinante

RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO…. 2h 1.5 h 1h 0 Después de la inducción

Proteina GFP

Purificación de la proteína recombinante https://www.youtube.com/watch?v=r2P1S_U3_pA