Marina Verónica Cápula Pneumocystis jiroveci Marina Verónica Cápula María Cecilia Zanotto Residencia Htal.“Juan A. Fernández”

Infección producida por Neumocistosis Infección producida por “Pneumocystis” Eucariota Unicelular Distribuido universalmente Tropismo por vías respiratorias Afecta diversas especies de mamíferos Humano a patógeno oportunista

Neumopatía con severo compromiso intersticial Malnutrición Trasplantados Citotóxicos o Corticoides Patógeno OPORTUNISTA Inmuno deficiencias Congénitas Onco hematológicos SIDA Cuadro típico: Neumopatía con severo compromiso intersticial a “PCP”

Evolución Histórica Hasta fines ’80s: “Protozoo” 1912 – Carinii y Delanoi Entidad separada a “P. carinii” 1900 1970 1950 1920 2000 1960 1990 1980 1909 – Chagas 1950 – 2° Guerra Mundial Se le asigna importancia patógena (Vanek y Jirovec) 1960 – 1ros casos en ICs 1988 – Análisis de ADN “Reino Fungi”

¿Hongo o Protozoo? Hongo Ultraestructura de pared quística ~ hongos Cuerpos intraquísticos ~ ascosporas de los Ascomycetes Polisacáridos de la pared quística del tipo β1,3-Glucano Material genético con alta homología con los hongos Protozoo Fuertes similitudes morfológicas Imposibilidad de propagación contínua in vitro Respuesta a los fármacos antiparasitarios y no a las drogas antifúngicas Carece de ergosterol Posee colesterol como principal esterol de membrana

Pared y membrana celular Ergosterol Hongo Colesterol Pneumocystis

1900 1970 1950 1920 2000 1960 1990 1980 Evolución Histórica Hasta fines ’80s: “Protozoo” 1912 – Carinii y Delanoi Entidad separada a “P. carinii” 1909 – Chagas 1950 – 2° Guerra Mundial Se le asigna importancia patógena (Vanek y Jirovec) 1960 – 1ros casos en ICs 1988 – Análisis de ADN “Reino Fungi” Biología molecular: PCR (Wakefield) + secuenciación ADN: Heterogeneidad genética + Multiplicidad de especies a “P. carinii f. sp. hominis”

P. carinii f. sp. oryctolagi Los “Pneumocystis” de diferentes mamíferos son muy distintos entre sí... Cerdos P. carinii f. sp. suis Ratones P. carinii f. sp. muris Pneumocystis Conejos P. carinii f. sp. oryctolagi Ratas P. carinii f. sp. carinii P. carinii f. sp. ratti Equinos P. carinii f. sp. equis Hurones P. carinii f. sp. mustelae Humanos IC P. carinii f. sp. hominis

Evolución Histórica Hasta fines ’80s: “Protozoo” 2001 – International Workshop on Opportunistic Protists Consenso: P. jiroveci Acrónimo PCP conservado (Pneumocystis Pneumonia) 1912 – Carinii y Delanoi Entidad separada a “P. carinii” 1900 1970 1950 1920 2000 1960 1990 1980 1909 – Chagas 1950 – 2° Guerra Mundial Se le asigna importancia patógena (Vanek y Jirovec) 1960 – 1ros casos en ICs 1988 – Análisis de ADN “Reino Fungi” Biología molecular: PCR (Wakefield) + secuenciación ADN: Heterogeneidad genética + Multiplicidad de especies a “P. carinii f. sp. hominis”

Epidemiología

Epidemiología I existe un antes y un después de la terapia HAART Frecuencia: Enfermedad rara y poco frecuente Neumonía común y enfermedad marcadora de SIDA ‘80s Epidemia del SIDA 1989 – Quimioprofilaxis anti-PCP a i incidencia existe un antes y un después de la terapia HAART

Emerging Infectious Diseases, Vol.10, Nro.10, Octubre 2004 Tasa de infecciones oportunistas tempranas por 1000 individuos-año EEUU – Período 1994-2001 Emerging Infectious Diseases, Vol.10, Nro.10, Octubre 2004

¿Qué pasó en Argentina?

Candidiasis esofágica Toxoplasmosis cerebral PRIMERAS ENFERMEDADES MARCADORAS SELECCIONADAS(*) EN MAYORES DE 12 AÑOS (ARGENTINA 1982-2000) Casos Neumonía P. jiroveci TBC Sindrome desgaste Candidiasis esofágica Toxoplasmosis cerebral Criptococosis 1982-90 31.1 8.9 12.2 9.7 4.6 4.5 1991-92 27.8 9.4 12.6 6.3 6.4 4.3 1993-94 32.3 13.5 6.7 8.5 8.3 5.3 1995-96 20.1 21.5 (+) 6.0 9.5 7.8 1997-98 13.9 19.4 (+) 8.7 7.1 6.6 1999-00 12.7 19.1 (+) 10.8 6.8 9.2 5.9 Totales 21.4 16.9 8.4 8.1 7.3 5.8 Neumonía por P. jiroveci 1993-94 * Se consideran las enfermedades marcadoras de mayor frecuencia. (+) La TB pulmonar representa el 45% del total en el período 1995-96, 62% en 1997-98 y 63% en 1999-2000. Boletín sobre SIDA en la República Argentina . Septiembre 2000. Ministerio de Salud. Unidad coordinadora - ejecutora HIV/ SIDA y ETS. Año vii- Nº 19 - Sept. 2000

Neumonía Intersticial Linfoidea PRIMERAS ENFERMEDADES MARCADORAS SELECCIONADAS(*) EN MENORES DE 13 AÑOS (ARGENTINA 1982-2000) Casos Infección Bacteriana Múltiple Sindrome de desgaste Encefalopa tía por HIV Neumonía P. jiroveci Neumonía Intersticial Linfoidea Retardo de maduración 1982-90 49.3 5.3 8.0 9.3 6.4 1991-92 48.8 3.3 14.0 6.6 9.9 1993-94 42.9 13.1 5.7 14.7 11.0 0.4 1995-96 50.0 8.9 10.2 3.4 5.2 7.3 1997-98 48.3 5.8 2.8 2.7 1999-00 4.0 6.0 7.0 Totales 48.0 7.7 6.2 6.1 Neumonía por P. jiroveci 1993-94 *Se consideran las enfermedades marcadoras de mayor frecuencia. Boletín sobre SIDA en la República Argentina . Septiembre 2000. Ministerio de Salud. Unidad coordinadora - ejecutora HIV/ SIDA y ETS. Año vii- Nº 19 - Sept. 2000

EVOLUCION DE ENFERMEDADES MARCADORAS SELECCIONADAS EN MAYORES DE 12 AÑOS (ARGENTINA 1982-2000) PCP TBC Boletín sobre SIDA en la República Argentina . Septiembre 2000. Ministerio de Salud. Unidad coordinadora - ejecutora HIV/ SIDA y ETS. Año vii- Nº 19 - Sept. 2000

Microorganismos aislados en muestras de BAL en pacientes HIV(+) Laboratorio de Microbiología del Hospital Juan A. Fernández (Período 1991-1998)

Epidemiología II Detección de Acs a edad temprana a exposición frecuente Reactivación infección adquirida durante infancia g NO! Adquisición activa o de novo de μorg transportados por el aire PCR g ADN P. jiroveci TR individuos sanos y asintomáticos post-contacto con pacientes PCP(+) Aire de habitaciones de pacientes PCP(+) “Portadores o Carriers”: Fuentes de transmisión interhumana Portación de carácter transiente (>75% negativiza a los 6m)

Características morfológicas

Tres estadíos morfológicos Morfología Tres estadíos morfológicos Trofozoítos Quistes 2-8 μm 4-8 μm 1-2 μm Cuerpos Intraquísticos o esporozoítos

Trofozoítos Pleomórficos Tamaño: 2 a 8 μm Pared delgada Un núcleo (a veces 2 ó más) de 0.5 a 1 μm Filópodos T A Trofozoíto de P. jiroveci por microscopía de transmisión electrónica (x5400)

Ultraestructura del trofozoíto de P Ultraestructura del trofozoíto de P. jiroveci por microscopía de transmisión electrónica (x7000) – Sung Tae Hong 8 μm

Quistes Esféricos (mayoría), forma de taza o medialuna Tamaño: 4 a 8 μm Pared quística 3 capas (70-140nm) coloraciones específicas “Dots”a adelgazamientos focales 4 poro irregular 4 liberación de CIQ ¿? CIQ “DOT” A Ultraestructura por microscopía de transmisión electrónica de un quiste maduro de P. jiroveci. Se observan sombras de CIQ y el adelgazamiento focal de la pared (flecha) - (x28800)

Quistes Mb externa electrondensa Mb media electronlucida Mb interna o plasmalema 70-140nm Ultraestructura por microscopía de transmisión electrónica de la pared quistica (x59400)

Coloración Gomori-Grocott Coloración Gomori-Grocott.- Se observan quistes redondeados y con forma de taza (diámetro de 7 µm) con dots en su pared

Cuerpos Intraquísticos Tamaño: 1 a 2 μm En cada quiste maduro a hasta 8 cuerpos intraquísticos Morfología quística 1 cantidad de CIQ Coloración de Giemsa 100x. Quiste de Pneumocystis con ocho esporozoítos

Ciclo de vida probable Inhalación de QUISTES Individuo INMUNOCOMPROMETIDO Inhalación de QUISTES Trofozoítos haploides (n) Esporozoítos libres (n) (ampliamente diseminados en el ½ ambiente) (2n) COPULACIÓN RUPTURA DEL QUISTE h Ruptura QUISTES a liberación CIQ a diferenciación a TROFOZOÍTOS Prequistes diploides (2n) Quiste maduro MEIOSIS I Y II + MITOSIS Trofozoíto mitocondria glucógeno núcleo Quiste temprano (n) MADURACIÓN Fisión binaria y/o endogamia rápido del n°organismos

Patogenia

HEMATOSIS QUISTES Quiste CIQ Verdadera forma infectante Individuo IC Trofozoito Verdadera forma infectante Individuo IC Filópodos Adhesión a mb celular de NEUMONOCITO I Fibronectina Descamación de paredes alveolares Proliferación de T Formación de Q Rc del huésped a inflamación y exudado proteináceo Penetración del μorg al interior celular Proliferación del μorg Muerte celular NEUMONOCITO II: Reacciona proliferando Condensación del relleno a obstrucción de bronquiolos más finos Engrosamiento del intersticio pulmonar x hiperplasia e hipertrofia de NMC II y x infiltración linfoplasmocelular Edema de los tabiques interalveolares HEMATOSIS Relleno espumoso característico en los alvéolos

Estructura de un alvéolo normal PMN NMC I NMC II Céls endoteliales PMN NMC I Estructura de un alvéolo normal

Alvéolo ocupado por exudado fibrinoso y áreas de aspecto granular y "espumoso". Nótese los tabiques engrosados con infiltración linfoplasmocelular. HE, 40x

Presentación Clínica

Factores de Riesgo Factores de riesgo para PCP en pac. HIV(+) LT CD4+ < 200 células/mm3 Fiebre de causa desconocida >37.7°C por más de 2 semanas Historia de candidiasis orofaríngea u otra enfermedad marcadora de SIDA Episodio previo de PCP Risk defined in 1997 U.S. Public Health Service Guidelines

Clínica Asintomática Infantil epidémica o neumonía plasmocitaria Formas respiratorias esporádicas en inmunodeficientes Extrapulmonar

Las manifestaciones clínicas en INMUNODEFICIENTES poseen tres componentes Síndrome Toxi-infeccioso Fiebre > 38ºC Sudores nocturnos Astenia Anorexia Pérdida de peso Síndrome Respiratorio Disnea Taquipnea Tos seca Cianosis Signos Rx Sugestivos pero inespecíficos Indican “daño pulmonar”

Correlación entre el patrón radiológico y resultados microbiológicos obtenidos por BAL en pacientes HIV(+) Objetivo: Determinar si existe correlación entre el tipo de infiltrado hallado en la Rx de tórax y el resultado positivo (aislamiento microbiológico) del BAL Población: n=506 (428 hombres y 78 mujeres) Edad promedio: 33.65±7.66 años Tipo de muestra: BAL de pacientes HIV(+) con SF persistente Resultados: La correlación entre patrón Rx y el resultado (+) del BAL fue: Rho de Sperman = -0.004 (p=0.920) Conclusiones: No se encontró un hallazgo Rx que permita inferir que el resultado del BAL será (+), ni el tipo de gérmen tipificado en pacientes HIV(+)

Neumocistosis extrapulmonar Pentamidina nebulizada Clínica Fiebre elevada Astenia Anorexia Pérdida de peso Disnea Hepatoesplenomegalia Lesiones papulosas o nodulares en piel Derrame pleural Pérdida de la agudeza visual Pleura Hígado Bazo Médula ósea Ojos

Diagnóstico

Diagnóstico I Estudios no específicos Centellografía con Galio Nebulizaciones con Tc 99m Dosaje de LDH

h LDH Asociada a daño de parénquima pulmonar Se correlaciona con el grado de hipoxemia Útil para establecer pronóstico Un resultado normal NO EXCLUYE PCP

Diagnóstico II Otras metodologías Ensayos serológicos: Detección de Acs anti-Pneumocystis Existen Acs desde edad temprana a FP IC severo: Título muy i a FN Biología molecular: PCR JS a muestra no invasiva (buches, gargarismos) h costo Presencia de ADN en el ambiente Indistinguible infección de portación

Diagnóstico III FUNDAMENTO: El diagnóstico definitivo de PCP se basa en la demostración morfológica del microorganismo por microscopía

Tipos de muestra Esputo inducido BAL Otros especímenes derivados de TR Biopsia transbronquial Biopsia de pulmón a cielo abierto

Esputo Inducido Preparación del paciente Inhalación de Sc. NaCl 3% ESPUTO MUCOIDE-TRANSLÚCIDO Mucólisis / NAC 0.5% Fijados con MEOH/Acetona Centrifugación COLORACIÓN

Fijados con MEOH/Acetona BAL Se instilan 100-150 ml de SS 0.85% FBC Se recuperan 50-60 ml Centrifugación COLORACIÓN Fijados con MEOH/Acetona

Procesamiento de las muestras Observación en fresco Coloraciones de pared quística Coloraciones de elementos no quísticos Coloración en fresco

Examen en fresco (10x) de un BAL Acúmulos de P. jiroveci Htal. Juan A. Fernández Microbiología

Examen en fresco (40x) de un BAL Acúmulo de P. jiroveci Htal. Juan A. Fernández Microbiología

Examen en fresco con Gram-Neisser (40x) - BAL Acúmulos de P. jiroveci Htal. Juan A. Fernández Microbiología

Examen en fresco con Gram-Neisser (100x) - BAL Acúmulos de P. jiroveci Htal. Juan A. Fernández Microbiología

Coloraciones de Pared FUNDAMENTO: Se colorea debido a la composición de la pared del quiste que contiene polísacáridos, quitina y polímeros de glucanos PAS Gomori-Grocott (Metenamina Plata) Azul de Toluidina O Gram-Weigert Blanco de Calcoflúor

Gomori-Grocott metenamina plata Gomori-Grocott metenamina plata. La pared quística se tiñe de negro y se observa la forma esférica, de taza o medialuna. Los CIQ no toman la coloración (100x)

Gomori-Grocott (100x) Quistes de Pneumocystis jiroveci en pulmón

Azul de Toluidina O (100x) Pneumocystis jiroveci en pulmón

Azul de Toluidina O (100x) Pneumocystis jiroveci en una muestra de aspirado bronquial

Coloración de Gram-Weigert (100x)

Coloración de Gram-Weigert BAL positivo para P. jiroveci

Coloración de Gram-Weigert - BAL positivo para P. Jiroveci (100x)

Pneumocystis jiroveci (Coloración: Blanco de Calcoflúor en BAL)

Coloración inmunofluorescente Calcoflúor (filtro verde) Clump de P. jiroveci Coloración inmunofluorescente Calcoflúor (filtro verde)

Coloraciones de las estructuras no quísticas FUNDAMENTO: Permiten la observación de trofozoítos y cuerpos intraquísticos Giemsa Modificaciones rápidas del Giemsa IF (única que permite ver Q, T y CIQ)

TROFOZOITO CIQs Giemsa. Trofozoítos con núcleos púrpura y citoplasma celeste pálido (derecha). Los quistes no se tiñen, pero sí los CIQ (izquierda) -100x-

Coloración de Giemsa (100X)- BAL Histoplama capsulatum Acúmulos de P. jiroveci Htal. Juan A. Fernández Microbiología

Y en la práctica… ¿Qué hacemos? Hospital “Juan A. Fernández” Otras coloraciones de pared (Gram-Weigert) BAL Ante una imagen dudosa Observación en fresco Coloración en fresco Otra coloración: Giemsa un observador experimentado puede llegar al diagnóstico !

Sulfametoxasol + Trimetroprima Tratamiento Sulfametoxasol + Trimetroprima 80% de éxito 25% pacientes sufre efectos colaterales (citopenia) Se puede usar junto a Leucovorina Otras alternativas: Pentamidina e.v., Trimetroprima + Dapsone, Clindamicina + Primaquina, Atavacuone y Trimetrexate

Disminuir el riesgo de recidiva Profilaxis Disminuir el riesgo de recidiva Reducir la incidencia Profilaxis primaria Profilaxis secundaria En pacientes con compromiso grave de la inmunidad CD4+ < 200/uL Tratamiento de mantenimiento en pacientes que sufrieron PCP Tasa de recidiva 50-60%

Conclusiones

Conclusiones La incidencia de PCP está subestimada. El diagnóstico de esta enfermedad es exclusivo del laboratorio. No existe una coloración Gold-Standard. Es aconsejable realizar coloraciones complementarias.

Y especialmente a nuestros compañeros de residencia AGRADECIMIENTOS Dra Sara Kaufman. Jefa de Microbiología, Laboratorio Htal J. A. Fernández. Dra L. Guelfand. Sección Micología, Laboratorio Htal J. A. Fernández. Dr. L. Germani. Servicio de Neumonología, Htal J. A . Fernández. Dr. H. Pérez. Servicio de Infectología, Htal J. A . Fernández. Y especialmente a nuestros compañeros de residencia ¡Eso fue todo amigos!

Gracias por su atención