1.3 Funciones de las proteínas 1.3.1 Enzimas

ENZIMAS

ENZIMAS Son moléculas de naturaleza proteínica que aceleran las reacciones bioquímicas. Son catalizadores biológicos que disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reacción. Figure 1-3

¿QUÉ ES UN CATALIZADOR? Es una molécula inorgánica u orgánica que incrementa notablemente la velocidad de las reacciones químicas sin ser modificada o consumida en la reacción.

Reacción enzimática simple E + S ES EP E + P E : enzima libre. S : sustrato. ES : complejo enzima-sustrato. EP: complejo enzima producto. P : producto.

Cinética vs termodinámica Las reacciones proceden espontáneamente si hay un descenso en la energía libre cuando la temperatura y la presión se mantienen constantes. Muchas reacciones bioquímicas, que son termodinámicamente posibles, ocurren a velocidades despreciables, es decir son cinéticamente imposibles. De aquí la necesidad de la catálisis para incrementar sus velocidades. La catálisis en las células la llevan a cabo las enzimas.

Cinética vs termodinámica • Lo que determina si una reacción es termodinámicamente posible es el valor del cambio en energía libre (ΔG). • Lo que determina si una reacción es cinéticamente posible es el valor de su energía de activación (ΔG‡).

El cambio negativo en energía libre (ΔG), o lo que es lo mismo el valor mayor de uno de la constante de equilibrio (Keq), nos dice que la reacción procede espontáneamente de S a P.

ΔGo´ = -RT ln Keq Relación entre la energía libre y la constante de equilibrio ΔGo´ = -RT ln Keq

Las enzimas, como cualquier catalizador, incrementan notablemente la velocidad de las reacciones químicas al disminuir su energía de activación sin ser modificadas o consumidas en la reacción.

Reacción no catalizada Reacción catalizada

Necesidad de la biocatálisis ¿Por qué la gran mayoría de las reacciones en los seres vivos necesitan ser catalizadas para que ocurran a una velocidad apreciable? Porque de lo contrario estarían todas en el equilibrio. Porque así la célula puede regular en forma diferencial su velocidad, regulando la actividad de los catalizadores de cada una de ellas.

Ventajas de las enzimas sobre los catalizadores inorgánicos Velocidades de reacción más elevadas, son más eficientes. (105- 1017). Condiciones de reacción más suaves. (T<100°C, presión atmosférica, pH fisiológico). Mayor especificidad de reacción. (sustratos, reactivos, no subproductos). Capacidad para la regulación. Ej. control alostérico, modificación covalente,  [enzima].

¿QUÉ TANTO ACELERAN LAS ENZIMAS LAS VELOCIDADES DE LAS REACCIONES? La reacción en que una molécula de orotidina monofosfato (ácido orotidílico) pierde un CO2 ocurre 1017 veces más rápida cuando es catalizada por la enzima orotidina monofosfato descarboxilasa que cuando no es catalizada. 1017 = 100 000 000 000 000 000 CIEN MIL BILLONES DE VECES MÁS RÁPIDA Ácido orotidílico Ácido uridílico (UMP)

*Ejercicio 1. Aumento de la tasa de hidrólisis La ureasa aumenta la tasa de hidrólisis de la urea a pH 8.0 y 20°C por un factor de 1014. Una cantidad de ureasa puede hidrolizar completamente una cantidad dada de urea en 5.0 min a 20 °C y pH 8.0. ¿Cuánto tardará en hidrolizarse esta misma cantidad de urea en ausencia de la enzima y bajo las mismas condiciones? 9.5 x 108 años.

Respuesta La ureasa aumenta la tasa de hidrólisis de la urea 1014 veces en las condiciones dadas. Si en 5 min hidroliza completamente la urea, sin la enzima tardaría: 5 min x 1014 = 5x1014 min.

Especificidad de la catálisis enzimática La catálisis enzimática requiere: Unión específica de la proteína a las moléculas de sustrato y de moléculas reguladoras. Reactividad específica de la proteína con el (los) sustrato (s).

Unión específica Las moléculas que van a reaccionar, llamadas sustratos, se unen a una región en la superficie llamada sitio activo.

La unión de la enzima quimotripsina a su sustrato en el sitio activo.

Teorías de unión específica del sustrato Existen dos teorías para explicar la unión específica: Teoría de la llave y la cerradura. Teoría del ajuste inducido.

Teoría de la llave y la cerradura

Tetrahidrofolato reductasa. Ejemplo de la teoría llave-cerradura.

Teoría del ajuste inducido

Cambio conformacional de la hexocinasa inducido por su sustrato

ENZIMAS Holoenzima = Una enzima completa, catalíticamente activa junto con su coenzima o ión metálico unidos. Holoenzima = Parte proteínica + parte no proteínica. Holoenzima Parte proteínica: apoenzima o apoproteína. Parte no proteínica: Cofactores: uno o mas iones inorgánicos. Coenzimas: moléculas orgánicas o metaloorgánicas complejas. Grupo prostético: cofactor o coenzima unido covalentemente a la enzima.

Coenzimas: Moléculas orgánicas o metaloorgánicas complejas

Tipo de reacción catalizada CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS Clasificación Tipo de reacción catalizada Ejemplos Oxidorreductasas. Reacciones de oxidación-reducción. Deshidrogenasas, oxidasas, peroxidasas. Transferasas. Transferencia de grupos funcionales. Transaminasas, cinasas, transacetilasas, metiltransferasas, aciltransferasas, glucosiltransferasas. Hidrolasas. Reacciones de hidrólisis. Esterasas, fosfatasas, glicosidasas, proteasas. Liasas. Eliminación de grupo para formar enlaces dobles. Descarboxilasas, aldehído liasas, cetoácido liasas. Isomerasas. Isomerización. Racemasas, epimerasas. Ligasas. Formación de enlace acoplada con la hidrólisis de ATP. Sintetasas.

ALCOHOL DESHIDROGENASA (EC 1.1.1.1) • Clase: 1 (oxidorreductasa). • Subclase: 1 (actúa sobre un sustrato que posee un grupo CH-OH como donador de electrones). • Subsubclase: 1 (NAD+ o NADP+ es la coenzima aceptor). • Orden dentro de la subsubclase: 1 (primera enzima de este grupo). EC= Comisión de enzimas.

CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS Estereoespecificidad: sustratos quirales, las enzimas actúan sobre sustratos L o D, pero no sobre ambos. Las enzimas son estereoespecíficas porque forman varias interacciones entre aminoácidos del centro activo y los distintos grupos del sustrato. Especificidad geométrica: las enzimas son selectivas hacia la identidad de los grupos químicos situados en los sustratos. Sitio activo vacío Sitio activo ocupado

CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS Sitio activo: lugar donde se lleva a cabo la catálisis enzimática. Sitio de unión a sustrato: Sitios químicos capaces de unirse al sustrato. Sitio alostérico: Lugar de unión a moléculas pequeñas, cuyo efecto es un cambio en el sitio activo o en el sitio de unión al sustrato lo que modula la actividad enzimática.

Ejercicio 2. Requerimiento del sitio activo La carboxipeptidasa, la cual remueve residuos de aminoácidos del extremo carboxilo de sus sustratos peptídicos, es un polipéptido de 307 aminoácidos. Los dos residuos de aminoácidos catalíticos son Arg145 y Glu270. Si la carboxipeptidasa fuera una α hélice, ¿Qué tan lejos estarían los residuos Arg145 y Glu270? Explique cómo los dos residuos de aminoácidos pueden catalizar una reacción que ocurre en un espacio de pocos Å. a) 190 Å. b) El plegamiento tridimensional de la enzima hace que los aminoácidos Arg145 y Glu270 queden cerca.

Respuesta En una α hélice cada 3.6 residuos de aminoácidos hay una distancia de 5.4 Å. La distancia entre Arg145 y Glu270 son de 125 residuos de aminoácidos.

Respuesta b) ¿Cómo los dos residuos de aminoácidos pueden catalizar una reacción que ocurre en un espacio de pocos Å? El plegamiento tridimensional de la enzima hace que los aminoácidos Arg145 y Glu270 queden cerca.

Unidades de actividad enzimática 1 unidad internacional (U) = 1 mmol de producto formado/min. 1 katal = 1 mol de producto formado/s. Actividad específica U/mg de proteína. katal / mg proteína.

Reacción catalizada enzimáticamente Reversible. Irreversible simplificada.

Parámetros enzimáticos Definición Km (constante para cada enzima). Concentración de S a la que V0 es ½ Vmax. Es una medida de la afinidad de la enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad de la enzima por S. Kcat o número de recambio. Número de moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones saturantes del sustrato. Vmax Velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato.

REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

*Ejercicio 3 Una enzima que cataliza la reacción X Y se aisló de dos especies bacterianas diferentes. Las enzimas tienen el mismo valor de Vmax, pero diferente valor de Km para el sustrato X. La enzima A tiene un valor de Km de 2.0 mM, mientras que le enzima B tiene un valor de Km de 0.5 mM. En la siguiente gráfica se presenta la cinética de la reacción a la misma concentración de ambas enzimas. ¿Qué curva corresponde a la enzima A y cual a la enzima B? Enzima B Enzima A

ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con el sustrato.

Unidades de los parámetros cinéticos

Velocidad máxima (Vmax) • Es la velocidad límite a la que tiende la reacción catalizada por enzimas a concentraciones saturantes del sustrato, es decir cuando toda la enzima está como ES. Vmax = kcat[E]total • Su valor cambia durante el proceso de purificación porque cambia la [E].

Constante catalítica (kcat) • Sólo puede conocerse cuando se tiene a la enzima pura y por tanto se conoce su concentración. kcat = Vmax / [E]total o kcat = Vmax / [sitios activos] • Si uno de los pasos es limitante de la velocidad, kcat es la constante de velocidad de este paso. • A kcat también se le conoce como número de recambio, porque indica el número máximo de ciclos catalíticos por sitio activo y por unidad de tiempo.

Ejercicio 4. Número de recambio La anhidrasa carbónica de los eritrocitos (Mr 30,000) cataliza la hidratación de CO2 y tiene uno de los mayores números de recambio que se conocen. H2O + CO2 H2CO3 Este es un proceso importante en el transporte de CO2 de los tejidos a los pulmones. Si 10.0 µg de anhidrasa carbónica cataliza la hidratación de 0.3 g de CO2 en un minuto a 37oC a Vmax. ¿Cuál es el número de recambio (Kcat) de la anhidrasa carbónica? Expresarlo en min-1 Kcat ≈ 2.0x107 min-1

Respuesta H2O + CO2 H2CO3 Datos: 0.3 g CO2 10.0 µg de anhidrasa carbónica (Mr 30,000) cataliza la hidratación de 0.3 g de CO2 en un minuto.

Constante de Michaelis Menten (Km) • En todos los casos es la concentración de sustrato a la que v = Vmax / 2