Chávez Arteaga Karen Meza Cruzate Eduardo Palma Ramos Rocío

OBJETIVOS: Conocer el concepto de histamina, su función, los procesos en los que interviene, su localización y acción. Determinar la efectividad de los diferentes procesos de análisis para determinar el contenido de histamina presente en un alimento, sus beneficios y desventajas.

¿Qué es la Histamina? La histamina es una amina compuesta por un anillo imidazólico y un grupo etilamino como cadena lateral. Químicamente, la histamina es 2-(4-imidazol) etilamina y su fórmula es C5H9N3.

HISTAMINA Es el producto de la descarboxilación del aminoácido histidina, una reacción catalizada por la enzima L-histidin descarboxilasa. Es una amina hidrofílica vasoactiva (de ahí su nombre). Una vez formada, la histamina es almacenada o rápidamente inactivada. La histamina es catabolizada por la histamina-N-metiltransferasa y la diamina-oxidasa, y posiblemente sea capturada por algún transportador. Algunas formas de intoxicación alimentaria, se deben a la conversión de histidina en histamina en la comida descompuesta o mal refrigerada, como el pescado.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). La Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión o High pressure liquid chromatography (HPLC). El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica

Yellowfin (Thunnus albacares): se encuentra presente en aguas tropicales y subtropicales de la India. Además puede ser encontrado tanto en el océano Pacífico como en el Atlántico.

Skipjack o Barrilete (Katsuwonus pelamis): es un pescado de una amplia distribución y grandes migraciones. Su comportamiento es bastante cosmopolita en aguas calientes. Únicamente se encuentra ausente en el mar Negro.

Bigeye (Thunnus obesus): se encuentra en aguas calientes de la India y en los océanos Pacífico y Atlántico.

Tipos de HPLC Cromatografía de fase normal La cromatografía de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar

Tipos de HPLC Cromatografía de fase reversa La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17.

Tipos de HPLC Cromatografía de exclusión molecular La cromatografía de exclusión molecular, también conocida como cromatografía por filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificación

Tipos de HPLC Cromatografía de intercambio iónico En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado.

Tipos de HPLC Cromatografía basada en bioafinidad Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria

MÉTODO ELISA La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmuno ensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.

Tipos de ensayos ELISA ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas) Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

Tipos de ensayos ELISA ELISA indirecto Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmuno fluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran cantidad de antígenos.

Tipos de ensayos ELISA ELISA 'sandwich'. (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmuno complejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

MÉTODO FLUOROMETRICO

MÉTODO FLUOROMETRICO La determinación del contenido de histamina en muestras de pescado se fundamenta en el método fluorometrico, el cual se basa en que la histamina es extraída del atún por homogenización con metanol al 75% extracto es pasado a través de un intercambiador de resina aniónica con la finalidad de remover sustancias interferentes, el eluato reacciona con el O. phthaldehido (OPT) formando derivadas fluorescentes de histamina el cual es medido por el fluorometro y la histamina es cuantificada con

EQUIPOS Y / O MATERIALES   Balanza analítica Balanza gramera Beaker de 250 ml Columnas cromatográficas Kontes de 200 ml Cronómetro Dispensador de 0-10 ml Dispensador de 1-5 ml Embudo Fluorómetro Quantech Modelo FM 109515 Licuadora Matraz volumétrica de 100 ml Matraz volumétrica de 1000 ml Micropipeta de 1ml Pipeta automática de 1-5 ml Pipeta volumétrica ( 1,2,5 y 10 ml) Probetas graduadas de 100 ml Procesador de alimentos Tubos 12 x 75 mm Tubos cónicos de polipropileno de 50 ml

REACTIVOS Y/O SOLUCIONES Agua destilada Metanol ml concentrado (99.8% - 100%) Bihidrocloruro de histamina gr, concentración ( 99% ) Resina de intercambio iónico BIO – RAD – AGI – X8, 50 – 100 Mesh Ácido clorhídrico 0.1 N concentración (36.5 – 38%) Ácido clorhídrico 1,0 N Ácido fosfórico concentración (85%) Hidróxido de sodio 1.0 N Hidróxido de sodio 2.0 N O-phthaldehido 0,1% concentración ( 99.6 – 100 %) Solución Control estándar de histamina Solución estándar de histamina

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