EXPERIMENTACIÓN & RESULTADOS LACASAS ENZIMAS CLAVE PARA LA MEJORA DE LA VIABILIDAD CELULAR Y LA PRODUCTIVIDAD EN LOS PROCESOS DE PRODUCCIÓN DE ETANOL LIGNOCELULÓSICO A ALTAS CARGAS DE SUSTRATO Antonio D. Moreno1, Pablo Alvira2, Elia Tomás-Pejó3, David Ibarra4, Mercedes Ballesteros1 1CIEMAT, Departamento de Energía, Unidad de Biocombustibles, Madrid, España. 2LISBP, Université de Toulouse, CNRS, INRA, INSA, Toulouse, Francia. 3IMDEA Energía, Unidad de Procesos Biotecnológicos, Móstoles, España. 4INIA-CIFOR, Departamento de Productos Forestales, Laboratorio de Celulosa y Papel, Madrid, España. E-mail: david.moreno@ciemat.es INTRODUCCIÓN En la producción de etanol lignocelulósico resulta indispensable el trabajar a altas cargas de sustrato para alcanzar concentraciones de etanol superiores a los 40 g/L y garantizar la rentabilidad del proceso. Sin embargo, la presencia de ciertos productos de degradación de la biomasa (ácidos alifáticos, derivados del furano y fenoles) limita el proceso de conversión. En el presente trabajo se ha estudiado el uso de una lacasa de origen fúngico (Pycnoporus cinnabarinus) y otra de origen bacteriano (Metzyme) para reducir de forma selectiva los compuestos fenólicos y mejorar la fermentabilidad de los medios durante los procesos de Sacarificación y Fermentación Simultanea (SFS) del Material Pretratado Completo (MPC) o del Residuo Sólido Insoluble (RSI) a concentraciones altas de sustrato. EXPERIMENTACIÓN & RESULTADOS Lignocelulosa (Paja de trigo) A El tratamiento previo con lacasas (independientemente de su origen fúngico o bacteriano) permite un mayor número de células viables durante los procesos de SFS, siendo de especial importancia al inicio del proceso. Pretratamiento (Explosión por vapor: 200-220 ºC; 2,5 min) MPC MPC Filtración (Büchner) y Lavado (H2O) B En comparación con la lacasa bacteriana, la lacasa fúngica produjo una mayor reducción del contenido fenólico, garantizando la fermentabilidad de los medios tras incrementar la carga de sustrato de un 9% (p/p) a un 11% (p/p). RSI Biodetoxificación con lacasa (10 UI/g sustrato) + SFS (15 UPF/g de celulasa + 15 UI/g β–glucosidasa + 1 g/L levadura (peso seco)) Etanol Figura 2. Viabilidad celular durante los procesos de SFS del MPC al (A) 9% (p/p) y al (B) 11% (p/p). El proceso de biodetoxificación tuvo lugar durante las 8 h previas al proceso de SFS a 50 ºC. Los procesos de SFS se llevaron a cabo a 42 ºC con la levadura termotolerante K. marxianus CECT 10875. Figura 1. Esquema de las etapas seguidas en el presente trabajo para la conversión de la lignocellulosa (paja de trigo) en etanol. Incremento en la productividad volumétrica Tabla 1. Concentración de fenoles iniciales, producción máxima de etanol y rendimiento global en los procesos de SFS Condiciones SSF Tratamiento Fenoles Totalesa (g/L) Etanolmax Rendimientob (%) 9% MPC (p/p) K. marxianus 42 ºC Sin lacasa 1,6 ± 0,0 12,3 ± 0,1 65,1 ± 0,7 Lacasa bacteriana 1,3 ± 0,1 (19%) 12,2 ± 1,2 64,4 ± 6,3 Lacasa fúngica 0,4 ± 0,2 (75%) 13,8 ± 1,6 72,9 ± 8,7 11% MPC (p/p) 2,0 ± 0,2 1,3 ± 0,2 6,1 ± 1,0 1,6 ± 0,1 (20%) 1,2 ± 0,3 5,2 ± 1,1 0,6 ± 0,2 (70%) 16,7 ± 0,3 74,2 ± 1,0 25% RSI (p/p) S. cerevisiae 35 ºC 5,2 ± 0,3 30,0 ± 0,7 29,1 ± 0,6 1,9 ± 0,1 (63%) 58,6 ± 2,7 56,9 ± 2,3 aContenido en fenoles totales medido tras el tratamiento con lacasa previo al proceso de SFS. El porcentaje de reducción obtenido tras el tratamiento con lacasa se indica entre paréntesis. bRendimiento calculado teniendo en cuenta la glucosa potencial, la concentración de etanol máxima obtenida en 72 h de proceso y un rendimiento de conversión de glucosa a etanol de 0,51 g/g. Figura 3. Proceso de SFS del RSI al 25% (p/p) con la levadura S. cerevisiae Ethanol Red y a una temperatura de 35 ºC. Una etapa de prehidrólsis a 50 ºC fue necesaria para la liquefacción de los medios. En el caso de las muestras tratadas con lacasa, la enzima se añadió tras 21 h de prehidrólisis. CONCLUSIONES Los compuestos de degradación generados durante la etapa de pretratamiento de la biomasa lignocelulósica limitan el uso del MPC a altas cargas de sustrato. El tratamiento con lacasas anterior al proceso de SFS disminuye el contenido fenólico del MPC/RSI, garantizando un mayor número de células viables durante los procesos de SFS. En comparación a la lacasa bacteriana, la lacasa de origen fúngico permite una mayor reducción del contenido fenólico del MPC, favoreciendo los procesos de SFS con la levadura termotolerante K. marxianus CECT 1875. Un mayor número de células viables permite un aumento en las productividades volumétricas de etanol y trabajar a mayores cargas de sustrato. La combinación del tratamiento con lacasa junto con la utilización de microorganismos robustos como S. cerevisiae Ethanol Red y la utilización del RSI en lugar del MPC, permite alcanzar concentraciones de etanol superiores a las mínimas requeridas (40 g/L) para un proceso de destilación rentable y en un menor tiempo de proceso.