Aprox. 100 Aprox. 23 5’ 3’ Aprox. 35 5’ 3’ Aprox. 30 5’ 3’ A. H1 µ δ γ 1 α1 γ 5’ γ 2 γ 4 ε1 α2 IGH CADENA PESADA DE LAS IG 3’ Aprox. 35 κ1 κ 5’ 3’ IGK CADENA LIGERA κ DE LAS IG Figura 1. A. Estructura germinal de las cadenas de inmunoglobulinas (Ig). Las cadenas H, K y Lambda de las inmunoglobulinas cuentan con un gran número de segmentos variables posibles, además de los segmentos de diversidad y de unión. A partir de ellos se crea el inmenso repertorio de las inmunoglobulinas. Aprox. 30 λ1 λ1 λ1 λ2 λ2 λ3 λ3 λ7 λ7 5’ 3’ IGL CADENA LIGERA λ DE LAS IG Exón Líder Intrones Segmentos de Diversidad (D) Potenciador Segmentos Variables (V) Segmentos de Unión (J) Segmentos Constantes

Aprox. 50 5’ 3’ Aprox. 45 Aprox. 55 5’ 3’ Aprox. 5 5’ 3’ B. β1 β1 β1 β1 β2 β2 β2 5’ 3’ TCRB CADENA β Aprox. 45 Aprox. 55 α1 5’ 3’ TCRA CADENA α δ2 δ1 δ2 δ3 δ3 TCRD CADENA δ Figura 1B. Estructura germinal del TCR. Las cadenas del TCR también cuentan con un gran número de segmentos variables posibles, además de los segmentos de diversidad y de unión. El hecho de que la secuencia Delta se encuentre dentro de la cadena Alfa garantiza que al momento de reorganizarse uno no será posible que se reorganice el otro y así se evitan expresiones aberrantes del TCR. Aprox. 5 γ1 γ1 γ1 γ2 γ2 5’ 3’ TCRG CADENA γ Intrones Segmentos Variables (V) Segmentos de Unión (J) Potenciador Exón Líder Segmentos de Diversidad (D) Segmentos Constantes Silenciador

Figura 2. Proceso de recombinación del receptor del antígeno. En la figura se muestra el procesamiento de la cadena H de las inmunoglobulinas, pero los procesos son similares para las cadenas ligeras de Ig y el TCR. Este proceso permite obtener entre 1x1010-1x1018 combinaciones. Momentos antes de la transcripción del ADN se eliminan todos los segmentos constantes de la línea germinal excepto uno, siendo este el que se exprese. El segmento líder no se traduce a proteína. Adición de nucleótidos

LINFOCITOS B LINFOCITOS T IGH VH-VH TCRB Vβ-Jβ TCRB Dβ-Jβ Resultados Proliferaciones linfoides sospechosas Proliferaciones linfoides sospechosas Inmunodeficiencias Inmunodeficiencias Proliferaciones linfoides sospechosas de origen desconocido (B o T) Enfermedades autoinmunes Enfermedades autoinmunes IGH VH-VH TCRB Vβ-Jβ TCRB Dβ-Jβ Clonalidad Inconclusa Resultados Clonalidad Inconclusa IGK VK-JK IGK Kde TCRG Figura 3. Algoritmo para el estudio de la clonalidad en lesiones de potencial biológico desconocido Con el fin de utili+zar el tiempo y los materiales de forma práctica se recomienda el uso secuencial de los diversos tubos de PCR multiplex. Preferiblemente con Preferiblemente con Resultados IGK DH-JH and IGL TCRD Clonalidad Inconclusa Clonalidad Inconclusa Amplificación de perfiles por Heteroduplex Resultados

Figura 4. Ejemplos de aplicación de las técnicas de PCR para evaluación de clonalidad linfoide Control de calidad del ADN por medio de PCR Multiplex en electroforesis en Gel de Acrilamida 4% (BIOMED-2). MP. Marcador de peso 100pb. 1. Caso 1 Tejido FFEP. 2. Caso 2 Tejido FFEP 3. Caso 3 Tejido FFEP. 4. Tejido Fresco Congelado. 5. Sangre. Electroforesis en gel de acrilamida al 4% de producto de PCR Multiplex BIOMED-2 para TCR-Gamma Tubo B. 0. Agua. 1. Linfocitos 2. Caso 1 3. Caso 2. 4. Caso 3. 5. Control Positivo. MP. Marcador de peso 100 pb. Análisis de fragmentos por medio del programa genescan 4.0 del producto de amplificación del tubo c para evaluar rearreglos del TCR gamma (BIOMED-2). En la gráfica solo aparece el Control + ( Mezcla de células Jurkat y Peer).