DIAGNOSTICO POR AMPLIFICACION DE DNA ISOTERMICA - lamp

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Transcripción de la presentación:

DIAGNOSTICO POR AMPLIFICACION DE DNA ISOTERMICA - lamp Especialidad para el Diagnóstico de Laboratorio de Enfermedades Infecciosas en Veterinaria sgaldonovo@fvet.uba.ar Vet. Sabrina Galdo Novo. Esp

AMPLIFICACION DE DNA TERMOCICLADOR PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION) BAJA ESPECIFICIDAD ES ESPECIFICO PERO TIENE MUCHO BACKGROUND EN LECTURA POR DIGESTION DE FRAGMENTOS INESPECIFICOS – CARO NECESITA MUCLOTIDOS MODIFICADOS ??? PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION) NASBA (NUCLEIC ACID SEQUENCE-BASED AMPLIFICATION) 3SR (SEFL SUSTAINED SEQUENCE REPLICATION) SDA (STRAND DISPLACEMENT AMPLIFICATION) LAMP (LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) Notomi et al., 2000 Otros tipos de métodos para amplificación; helicase-dependent amplification (HAD) - Rolling circle amplification (RCA) - multiple displacement amplification (MDA) - recombinase polymerase amplification (RPA).

Materiales Utilizados Notomi et al., 2000 2 pares de primers tttt FIP tttt BIP F3 B3 FIP FORWARD INNER PRIMER (CEBADOR DIRECTO INTERNO) BIP BACKWARD INNER PRIMER (REVERSO)

Primer que formar el loop S Galdo Novo 2014

Fragmentos obtenidos Notomi et al., 2000

Materiales utilizados Polimerasa Bst pol DNA large fragment Polimerasa de B. stearotermophilus 60 a 65°C !!! 1 hora!!!

Materiales utilizados Betaina Estabiliza DNA Dntp´s Buffer con KCl, MgSo4, Triton x-100 S Galdo Novo 2014

Lectura rápida a campo La reacción produce pirofosfatos de magnesio los que producen turbidez A simple vista volumen de reacción para verlo LABORATORIO Turbidimetría ; OD con blanco. Requiere equipo.

Lectura rápida a campo Tinción con SYBR Green ok Wang et al., 2014

Lectura rápida a campo Tinción con Ioduro de propidio 1 mg/ml (2 ul) Simple vista Bajo luz UV ? ? S Galdo Novo 2014 S Galdo Novo 2014

Lectura en laboratorio. Corrida en gel agarosa 1x + Diferentes productos de distinto peso molecular - Restos de componentes de la reacción

La hora de la verdad ok

Conclusiones A campo - Con SYBR Green (algo más caro) - Turbidez o Ioduro, solo fuerte + o – (requiere experiencia. no es 100%) Laboratorio - Requiere equipamiento costo beneficio PCR ??????

Preguntas??? Referencias sgaldonovo@fvet.uba.ar Notomi et al., 2000. Loop – mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic acid research 28 (12). Zanoli et al., 2013. Isothermal Amplification Methods for the Detection of Nucleic Acids in Microfluidic Devices. Biosensors, 3, 18-43; doi:10.3390/bios3010018 Wang et al., 2014. Rapid and Sensitive Detection of Listeria ivanovii by Loop-Mediated Isothermal Amplification of the smcL Gene. Plos One 9(12): e115868. doi:10.1371/journal.pone.0115868

GRACIAS!!!!!!!