Cátedra de Bioquímica-UNNE 2016 Enzimas Cátedra de Bioquímica-UNNE 2016

Introducción Las ENZIMAS son catalizadores biológicos En los seres vivos Las ENZIMAS son catalizadores biológicos Reacciones químicas Eficiencia y Velocidad Catalizadores

No se consumen en el proceso No forman parte del producto Generalidades Aceleran una reacción No se consumen en el proceso No forman parte del producto Son específicas Su acción se realiza porque disminuyen la energía de activación de las reacciones

especificidad

Disminuyen la energía de activación de las reacciones

Enzima Sustrato Producto

nomenclatura Nombre del sustrato + sufijo asa (ureasa, amilasa, lipasa, etc) Designación en función del tipo de reacción catalizada (deshidrogenasas, descarboxilasas, etc.) Nombres arbitrarios (ptialina salival, tripsina, etc.)

nomenclatura Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular → Criterios de Clasificación y Nomenclatura 6 Clases de Enzimas → tipo de reacción catalizada Cada clase se divide en Subclases y Sub-subclases → naturaleza de los grupos de átomos involucrados en las reacciones Orden de aparición

Ejemplo

clasificación Clases de Enzimas → tipo de reacción catalizada 1. Oxidoreductasas 2. Transferasas 3. Hidrolasas 4. Liasas 5. Isomerasas 6. Ligasas

1- oxidoreductasas Requieren coenzimas!!!! Deshidrogenasas: el sustrato es donante de hidrógenos Oxidasas: cuando el aceptor de hidrógenos es el O2 Peroxidasas: cuando el H2O2 oxida a otro sustrato Oxigenasas: incorporan oxígeno al sustrato

Ejemplo oxidoreductasa Requieren coenzimas Lactato Piruvato 1.1.1.27

2- transferasas 2.6.1.1

3- hidrolasas Hidrolasas: cortan uniones entre: C-S, C-O, C-N y O-P

4- liasas Liasas: cortan uniones entre: C-C, C-S y C-N (no uniones peptídicas)

5- isomerasas Isomerasas : interconvierten isómeros

6- ligasas También llamadas SINTASAS Catalizan la formación de enlaces entre C y O,N,S y otros átomos Requiere de energía

Catálisis Enzimática

Estructura de una enzima Los aminoácidos (AA) constituyentes cumplen funciones diferenciadas: Los AA no esenciales pueden ser reemplazados y, en algunos casos, eliminados sin pérdida significativa en la función o conformación de una enzima. Los AA estructurales = conformación de la enzima, "forman su esqueleto". Los AA de unión = asociación entre la enzima y el sustrato. Los AA catalíticos = transformación del sustrato.

El centro activo comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción Centro activo: Es el sitio donde están los AA de unión al S y los AA que median el efecto catalítico de la enzima. (uniones intermoleculares de la enzima c/el S en una orientación tal que encajan correctamente, como las piezas en un rompecabezas).

El sustrato se une a la enzima luego se inicia la catálisis Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima Sitio catalítico

MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS Dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: el modelo llave-cerradura el modelo del ajuste inducido

MODELO LLAVE-CERRADURA La estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto

MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo de la enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto.

Cofactores - Coenzimas A veces, una enzima requiere p/su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: Los cofactores. Pueden ser iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de las enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima.

Cofactores - Coenzimas Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente a la enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa de la enzima = holoenzima. La parte proteica de una holoenzima se llama apoenzima (inactiva), de forma que: apoenzima + coenzima = holoenzima

Coenzima: NAD+ Deriva de la Vitamina B5 (ácido nicotínico)

Coenzima: FAD Es grupo prostético Deriva de la Vitamina B2 (flavina) FAD forma oxidada FADH2 forma reducida

CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima.

CINÉTICA ENZIMÁTICA

CINÉTICA ENZIMÁTICA MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN Finales del siglo XIX: estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato s/la actividad enzimática. En 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas.

La velocidad de una reacción La medida se realiza siempre en: Condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, C/concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). Se expresa en aparición de los productos o la desaparición de los reactivos

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbola . La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

El valor de KM da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato: La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante por varias razones: KM = [S] para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. El valor de KM da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato: a menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con las enzimas alostéricas, cuya gráfica de v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

Regulación de la actividad enzimática Como ocurre con toda proteína, la actividad de una enzima depende de factores tales como: la temperatura, el pH, las disoluciones salinas, los solventes, los activadores y los inhibidores, el tiempo de reacción.

Factores que afectan la cinética enzimática La actividad puede estar afectada por: pH - Temperatura - Fuerza iónica - Inhibidores

La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Por ello, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular Efecto el pH Variaciones del pH del medio producen cambios en el estado de ionización de algunos grupos de una enzima, afectando su estructura tridimensional y su actividad. El cambio en la ionización de grupos químicos del sitio activo puede alterar el reconocimiento del sustrato o la reactividad de los AA del sitio activo. Todas las enzimas tienen dos valores límites de pH entre los cuales son efectivas, más allá se desnaturaliza y deja de actuar.

Efecto de la Temperatura Factor temperatura Si aumenta la temperatura, aumenta la energía cinética de las partículas y su movilidad produciéndose un aumento en el número de colisiones y la velocidad de la transformación. Si la temperatura continúa aumentando, se comienzan a romper uniones intermoleculares (responsables de la conformación) y, así, comienza a disminuir su actividad. Si la TºC es excesiva, la enzima se desnaturaliza perdiendo totalmente sus propiedades catalíticas.

Factores que afectan la cinética enzimática: INHIBIDORES Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de una enzima: son los inhibidores. Irreversibles E + I  EI se unen fuertemente a la E y el complejo no se disocia Reversibles E + I ⇄ EI

Inhibidores Reversibles Pueden actuar de 3 modos: ocupan temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el S original: inhibidor competitivo Se unen a otro sitio en la Enz y alteran su conformación espacial, impidiendo su unión al S: inhibidor no competitivo Se unen al complejo E-S impidiendo la catálisis del sustrato: inhibidor acompetitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor competitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor no competitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

Regulación de la catálisis enzimática las concentraciones del sustrato y de los productos finales presencia de inhibidores modulación alostérica modificación covalente activación por proteolisis (zimógenos) isoenzimas

MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T

ACTIVADORES ALOSTÉRICOS Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R actuando s/una región de la Enz distinta del centro activo. Son los llamados moduladores positivos ó activadores alostéricos. El propio S es a menudo un modulador positivo.

INHIBIDORES ALOSTÉRICOS Las sustancias que favorecen la forma T y actúan en lugares distintos del centro activo de la enzima y disminuyen la actividad enzimática: son los moduladores alostéricos negativos.

Regulación de la actividad enzimática por MODIFICACIÓN COVALENTE Hay enzimas que pasan de la forma inactiva a la activa por unión covalente a un grupo químico de pequeño tamaño como el Pi o el AMP. También se da el caso inverso (E activa -> E inactiva) El enzima no fosforilado es inactivo El enzima fosforilado es activo

Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA Algunos enzimas no se sintetizan como E activa, sino como proteínas precursoras sin actividad enzimática. Estas proteínas se llaman proenzimas o zimógenos. Para activarse, los zimógenos sufren hidrólisis que origina la liberación de uno o varios péptidos. El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades de la enzima activa. Ej.: enzimas digestivas se secretan en forma de zimógenos y en el tubo digestivo se convierten en la forma activa. Es el caso de la quimotripsina, que se sintetiza en forma de quimotripsinógeno

Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR MEDIO DE ISOENZIMAS Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su función biológica es similar. Se llaman isozimas o isoenzimas. Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que cada isozima se adapta perfectamente a la función que debe realizar. Así, podemos observar la existencia de isoenzimas en función de: el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta isoezimas distintas en músculo y corazón. el compartimento celular donde actúa: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria. el momento concreto del desarrollo del individuo. Ej: algunos enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.

Bibliografía BLANCO, A.: Química Biológica, 7ma. ed., El Ateneo, Buenos Aires, 2000. BOREL, J.P.; RANDOUX, A.; MAQUART, F.X.; LE PEUCH, C. & VALEIRE, J.: Bioquímica Dinámica, 1ra. ed. en español, Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires, 1989. MURRAY, R; GRANNER, D; MAYES, P & RODWEL, V: Bioquímica de Harper, 15ta. ed., El Manual Moderno, México, 2000. VOET, D; VOET, JG & PRATT, ChW. Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular. 2º ed., Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires, 2007. www.medicapanamericana.com

MUCHAS GRACIAS !!!