Animales transgénicos y “knock out” para el estudio del cáncer Dr. Javier Santos Dpto. Biología. Fac. Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid

Bases genéticas del cáncer: mutaciones y/o modificaciones epigenéticas en proto-oncogenes y genes supresores de tumores   Los proto-oncogenes promueven el crecimiento y la proliferación celular, o inhiben la muerte celular (apoptosis). Su activación como oncogenes se produce por sobre-expresión o por mutaciones de “ganancia de función”, y se comportan como genes autosómicos dominantes. Los genes supresores (GSTs) tendrían un efecto contrario, y su participación en el desarrollo tumoral se debe generalmente a la inactivación de los dos alelos (carácter recesivo). Las mutaciones o modificaciones epigenéticas que los implican en la tumorogénesis son de “pérdida de función”. También se podrían incluir aquí los genes que controlan la reparación del daño genético.

Predisposición genética al cáncer

El ratón: un modelo excelente para el estudio de la genética al cáncer Cepas de ratón genéticamente uniformes  Protocolos de inducción de tumores contrastados  Reproducibilidad en el desarrollo de tumores específicos  Disponibilidad de cepas de ratón que difieren en su sensibilidad al desarrollo de tumores específicos  El desarrollo tumoral en el ratón sigue un proceso multifásico similar al de los tumores humanos  Equivalencia entre regiones ortólogas del genoma de ratón y el humano  Genoma susceptible de manipulación genética El ratón: un modelo excelente para el estudio de la genética al cáncer

Manipulación Genética en el Ratón y su Aplicación al Estudio del Cáncer Ratones TRANSGENICOS que SOBRE-EXPRESAN ONCOGENES Ratones con MUTACIONES INACTIVANTES (mutaciones knock-out) en GSTs (ratones KNOCK-OUT)

Construcción de Ratones Transgénicos

Construcción de Ratones Transgénicos

Construcción de Ratones Transgénicos Efectos no deseados del transgén: Inactivación del transgén debido al lugar de integración (efectos de posición). Mutagénesis por inserción del transgén

Los Efectos de Posición del Transgén se Minimizan Utilizando Cromosomas Artificiales de Levaduras (YACs) como Vectores de Transgénesis VENTAJAS Inclusión de todas las secuencias reguladoras necesarias para la expresión correcta del transgén INCONVENIENTES No evita totalmente la integración del transgén en el genoma huésped con el riesgo asociado de mutación por inserción

Ratones con Transgenes de Integración controlada La mutagénesis por inserción se puede controlar utilizando como vectores de transgénesis Cromosomas Artificiales de Mamíferos (MACs)

Ratones con transgenes de expresión tisular CSP GOI CSP: Promotor específico de tejido GOI: Gen de interés

Ratones con transgenes inducibles Impacto de la expresión oncogénica durante diferentes etapas del desarrollo Requerimientos necesarios para una actividad oncogénica sostenida ANÁLISIS

Ratones con transgenes inducibles tetO Pmin X Psp tetR VP16 tTA Psp: promotor específico de tejido tTA: proteína de fusión compuesta por el represor del operón tetraciclina (t) y la parte C terminal de la proteína 16 del virus del herpes (activador transcripcional) (TA) Pmin: promotor del citomegalovirus humano

Ratones con transgenes inducibles Psp tetR VP16 tTA tetO Pmin X +dox -dox dox: doxiciclina (análogo de la tetraciclina)

Ratones con transgenes inducibles Psp tetR VP16 tTA tetO Pmin X +dox -dox rtetR rtTA rtetR: proteína tetR con cuatro cambios aminoacídicos

Ratones con mutaciones diseñadas “ad hoc” Su construcción se basa en la RECOMBINACIÓN entre una MOLÉCULA de ADN portadora de la MUTACIÓN y su SECUENCIA HOMÓLOGA en el ADN genómico de las CÉLULAS CULTIVADAS IN VITRO Células embrionarias primordiales (células ES, del inglés Embryonic Stem) Las células ES mantienen INDEFINIDAMENTE sus características de PLURIPOTENCIA y ESTADO INDIFERENCIADO durante su crecimiento

Fabricación de Ratones “Knock-out” Ratones K O: individuos que tienen inactivado un gen (mutación K O) en todas sus células

Fabricación de ratones “Knock-out”

Fabricación de ratones “Knock-out”

Inactivación génica condicional con el sistema Cre-loxP Cuando la falta de función del gen compromete la viabilidad del animal en una etapa temprana, resulta imposible estudiar su papel en otros procesos durante etapas más tardías Necesidad de inducir la mutación KO en el tejido, organo o momento deseado

Inactivación génica condicional con el sistema Cre-loxP

Ratones “knock-in” Una modificación “knock-in” consiste en la incorporación de una SECUENCIA CODIFICANTE al mensaje del gen a modificar Incorporación mediante FUSIÓN al MARCO de LECTURA ENDÓGENO utilizando el ATG del gen modificado Incorporación mediante INSERCIÓN en las parte 5’ NO TRADUCIDA DEL MENSAJE utilizando un nuevoATG introducido la INTRODUCCIÓN de un ELEMENTO IRES (Internal Ribosomal Entry Site)

“Knock-in” de Sustitución Vector “knock-in” El gen endógeno se inactiva por inserción del exógeno que es entonces expresado Ex 1 Ex 2 Ex 3 Gen endógeno P endógeno 3’-UTR 5’-UTR “Knock-in” de Sustitución exógeno Transcripción TK Neo-r 1 Gen exógeno

El gen exógeno se expresa conjuntamente con el endógeno “Knock-in” de Adición endógeno 5’-UTR 3’-UTR P Gen endógeno Ex 1 Ex 2 Ex 3 exógeno P Gen exógeno Neo-r Ex 1 Ex 2 Ex 3 TK Vector “knock-in” endógeno Transcripción P Gen exógeno Neo-r Ex 1 Ex 2 Ex 3 El gen exógeno se expresa conjuntamente con el endógeno

Estrategia para la búsqueda de genes modificadores de tumores Identificar un locus modificador de tumor por análisis de ligamiento (ratones consómicos) Refinar la región (0.5 -1 cM = 1-2 Mb) para facilitar el clonaje del gen modificador (ratones congénicos) Identificar genes candidatos en la región donde se localiza el locus modificador Identificar polimorfismos funcionales en el gen candidato Demostrar in vivo que el gen candidato lo es con ratones transgénicos “knock-in”

Ratones consómicos X 1.75 Gy/dose x 4 weeks Strain B: C57BL/6 (Tumor-Sensitive) Strain A: Mus spretus (Tumor-Resistant) X F1 hybrid: (Mus spretus x C57BL/6J) F1 Successive backcrosses and/or subsequent intercrosses Sensitive Sensitive Resistant 19 Chr B + Chr 2 A or Chr 10 A Chr 19 A

Ratones congénicos Análisis de la incidencia de tumores Inducción del 19 Chr C57BL/6J Chr 19 Mus spretus D19Mit41-D19Mit60-D19Mit30-D19Mit39 chromosome interval +

Consómicos en fondo “knock-out”: una herramienta muy útil para buscar modificadores de genes supresores de tumores inactivados Cepa A: resistente Cepa B: sensible (Fenotipo KO) X Retrocruzamientos sucesivos e intercruce final 18 Cr B + KO Cr 19 A 19 Cr B Inducción del tumor