¿Qué debemos tener en cuenta en el manejo de la biopsia líquida? Beatriz Bellosillo Hospital del Mar, Barcelona SEAP, Madrid, Febrero 2017 1

Transl Lung Cancer Res 2016;5(5):466-482

Transl Lung Cancer Res 2016;5(5):466-482

Jung et al, Clinica Chimica Acta 411, 1611, 2010

Crowley et al, Nat Rev Clin Oncol 10:472, 2013

Jung et al, Clinica Chimica Acta 411, 1611, 2010

Clinical chemistry 61: 112, 2015

ADN Normal (Wild-Type) ADN tumoral (Mutado) ADN Normal (Wild-Type) Inostics Laboratory Validations (internal). Diehl F, et. al Analysis of mutations in DNA isolated from plasma and stool of colorectal cancer patients. Gastroenterology. 2008 Aug;135(2):489-98.

Detección de ADN tumoral circulante (Mutado) 1% 100% 10% 0.1% 0.01% BEAMing Real-Time PCR PCR digital Pirosecuenciación Secuenciación Sanger Sensibilidad de detección (ADN mutado/ ADN total) ADN normal (Wild-Type) Inostics Laboratory Validations (internal). Diehl F, et. al Analysis of mutations in DNA isolated from plasma and stool of colorectal cancer patients. Gastroenterology. 2008 Aug;135(2):489-98.

Detección de ADN tumoral circulante (Mutado) El procedimiento pre-analítico puede MODIFICAR (INCREMENTAR ) el ADN de tejido no tumoral en la muestra Sensibilidad de detección ADN Normal (Wild-Type) Inostics Laboratory Validations (internal). Diehl F, et. al Analysis of mutations in DNA isolated from plasma and stool of colorectal cancer patients. Gastroenterology. 2008 Aug;135(2):489-98.

ANALITICA PRE-ANALITICA Extraccion Transporte Separación plasma Extracción ADN PRE-ANALITICA ANALITICA

Brock et al, Translational Cancer Research 2015

Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

Suero versus plasma Plasma como mejor opción para estudiar CfDNA Mayor concentración de ADN en suero que en plasma Mayor variabilidad entre pacientes en suero que en plasma Lisis de leucocitos durante la formación del coagulo Las vesículas-CfDNA se unen a fibrinógeno y fibrina Pérdida de la fracción plaquetar Plasma como mejor opción para estudiar CfDNA

Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

Selección de tubo de recogida Anticoagulante : EDTA Heparina Citrato Adecuados si tiempo < 4-6 horas EDTA NO interfiere con PCR como la heparina Tubos EDTA como mejor opción para estudiar CfDNA

4h -6h

> 6h Lisis células hematológicas Aumento de la concentración de ADN Dilución del ADN tumoral circulante > 6h

Selección de tubo de recogida Diehl, AACR meeting 2016

Sherwood et al, PLOSone 2016

Procedimiento 2x 2 tubos EDTA/K3 Centrifugar 1600g x 10 min Alicuotar SN Extracción ADN

Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

Alicuotado y almacenamiento Low binding tubes para minimizar adsorción del ADN a paredes del tubo Polipropileno>polietileno Almacenamiento de las alicuotas de plasma a -80ºC (preservar RNA)

Efecto del almacenamiento en la conentración de CfADN El Messaoudi & Thierry

Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

Extracción de ADN

Suero o plasma Tipo de tubos Tiempo hasta el procesamiento Alicuotado y almacenamiento Extracción de ADN Cuantificación de ADN

Cuantificación de ADN Espectrofotómetro frecuentemente utilizado (A260/A280) menos preciso Métodos fluorescentes – PicoGreen – unión de fluorocromo a ADN de doble cadena inespecífico (ADN viral…) Cuantificación por qPCR buena correlación con PicoGreen más caro y laborioso ¿selección de gen diana?

Verificación de la calidad y cantidad de ADN DNA amplifiability is the best indicator of library performance. Comparing QC in matched FFPE (purple) and fresh frozen (green) samples, all but one sample (red) generated a successful library. With dCT cut off of 4, the sample preparation success rate is >99%. We see a range of 30-300ng suggested DNA input based on DNA quality.

Clinica Chimica Acta 412, 2085, 2011

El Messaoudi et al, CCA 2013

Superposición de los perfiles (rojo: QIAamp; azul: Magmax)

Importancia de la cuantificación de ADN

Máximo 4 horas desde la extracción 4 ºC o temperatura ambiente Extracción de sangre Almacenamiento de sangre Obtención del plasma Extracción cuidadosa 10 ml sangre K3EDTA Vacutainer Streck tubes Máximo 4 horas desde la extracción 4 ºC o temperatura ambiente Centrifugación a 2X 1200-1600g, 10 min Alicuotar 1-2ml 2ª centrifugación en microcentrifuga a 16000g, 1 min (antes o despues del almacenado) Almacenamiento largo plazo Almacenamiento de ADN extraido Almacenamiento de plasma Almacenamiento: -20º o -80ºC Evitar congelación-descongelación Almacenamiento: -20º Evitar congelación-descongelación Extraccion Cf DNA inmediata : 4ºC hasta 3 horas Extracción no inmediata: -20ºC ó -80ºC Evitar congelación-descongelación

Conclusiones El procedimiento pre-analítico NO está estandarizado y es crítico para obtener resultados de calidad El plasma sería la muestra más adecuada Hay que minimizar el tiempo entre la obtención de la muestra y el procesamiento en el laboratorio