Endotoxinas Bacterianas. Pirógenos Universidad de Los Andes Facultad de Farmacia y Bioanálisis Escuela de Bioanálisis Departamento de Microbiología y Parasitología Cátedra de Microbiología Aplicada – Farmacia Endotoxinas Bacterianas. Pirógenos Prof.. Andrea Colls Diciembre, 2016

REVISION DEL TEMA ANTERIOR -Productos estériles -pruebas de esterilidad -Prueba en placa y tubo -Periodo de incubación -Interpretación de resultados

Burdon Sanderson: designo como pirógeno a una sustancia piretógena que obtuvo de la carne putrefacta demostrando que procedía de bacterias vivas. Pirógenos Seibert, en 1923, confirmo que todas las llamadas fiebres de la inyección se debían a la presencia de pirógeno en el agua destilada, de procedencia bacteriana.

Pirógenos Son producto del metabolismo microbiano. Se incluyen: virus, sustancias químicas, endotoxinas y exotoxinas de bacterias gram negativas. Las bacterias gram positivas también producen pirógenos pero de menor potencia y de naturaleza químicamente diferente.

Pirógenos endógenos Son producidos por el huésped, generalmente en respuesta a estímulos provenientes de las infecciones o inflamaciones. (Citocinas e Interleucinas). Pirógenos exógenos Son ajenos a la persona, los más comunes son endotoxinas bacterianas, por ejemplo lipo-polisacáridos (LPS) que provienen de fragmentos de la membrana celular de bacterias Gram.-negativas.

Comparación de las envolturas celulares bacterianas FUENTE: Generalidades de bacteria. Departamento de Agentes Biologicos. Prof. Victor Cortez. Universidad de Buenos Aires. UBA. Argentina.

Control de pirógenos Los pirógenos son contaminantes en un producto farmacéutico. Pueden ingresar a un medicamento por cualquier medio que introduzca microorganismos vivos o muertos. La presencia de pirógenos en productos terminados es indicativa de un procesamiento realizado bajo condiciones de limpieza mal controladas. Se recomienda realizar procesos de fabricación con la mayor rapidez posible.

Síntomas de la reacción pirogénica en el hombre Bajas dosis de pirógenos inducen reacciones inflamatorias, sin síntomas clínicamente significativos. Dosis moderadas de pirógenos inducen fiebre y cambios significativos en la composición del plasma.

Fuentes de Contaminación Procesos de Fabricación Materia Prima Envases y Equipos El Agua (Preparación de productos estériles, Lavado de material que entra en contacto directo, Almacenamiento)

Eliminación de pirógenos Despirogenización de vidrios: Calentamiento a altas temperaturas, 250ºC x 45 min.; o 650ºC x 1 min.; o 180ºC x 4 h. El ciclo normal de autoclave no destruye pirógenos La ósmosis inversa y resinas de intercambio iónico eliminan pirógenos del agua. Calentamiento con álcalis diluido, tomando las precauciones de que se no se afectarán los constituyentes del producto. Destilación

Método de Análisis in vivo En un inicio, la presencia de pirógenos en agua y disoluciones acuosas se probaba inyectando la solución problema a conejos y esperando para observar si se presentaban signos de fiebre. Condiciones de Animales de Prueba Macho o Hembra. Buena salud ≥ 1.5 Kg. Ninguna pérdida de peso en la semana anterior al ensayo. Alimentación: un régimen equilibrado exento de antibióticos.

Condiciones del Ambiente Material de Ensayo Equipo de vidrio despirogenizado. - Solución por inyectar a una temperatura de 37ºC±2ºC, protegida de toda contaminación. - Volumen de la inyección: Según las monografías o 10mL/Kg. - Tiempo de inyección: ≤ 10 minutos. - Precisión de los Termometros:± 0,1ºC Condiciones del Ambiente Las salas de cuarentena, de estancia y de ensayos se climatizan en las mismas condiciones de ambiente. Temperatura 18 ±2ºC Humedad Regulada 50 ± 10%

Prueba del Conejo Se utilizan 3 conejos. 10 mL de la solución de prueba/Kg. en una vena de la oreja, tiempo de inyección 10min. Se registra la temperatura rectal a 1, 2 y 3 horas después de la inyección. Se permite una elevación térmica de 0.6 ºC para cualquier conejo y un total de 1.4ºC para los 3 conejos. Si estos límites se sobrepasa, incluir otros 5 conejos. el requisito establece que no más de 3 conejos pueden mostrar una elevación de 0.6ºC y la elevación térmica total para los 8 es de 3.7 ºC o menos.

Desventajas de este método Cría de Animales. Área especial para desarrollo del método. Estrés ocasionado a los animales. Imprecisiones del método.

LAL (Limulus Amebocyte Lysate) Es un extracto acuoso obtenido del lisado de las células sanguíneas (amebocitos) del cangrejo (herradura) Limulus Polyphemus. Si el lisado de estos amebocitos se enfrenta a una formulación que contiene pirógenos, se producirá un coágulo, pudiendo ser detectado y cuantificado. Coraza de un Limulus polyphemus o cangrejo herradura escaneada en distintas posiciones para apreciar su forma. 

Métodos de Ensayo de LAL Los métodos principales son: Método de Coagulación o Gel – Clot Método Turbidimétrico Método Cromogénico.

Método Gel - Clot Es la prueba más simple y la más usada. Es un método oficial, es decir, un método establecido en la USP y otras farmacopeas. Consiste en la mezcla de cantidades conocidas del reactivo de LAL con la muestra, incubación a 37ºC en baño de maría, durante una hora y posterior comprobación de evidencia coágulo.

Preparación del material y Muestra para el ensayo Sensibilidad del lisado. Que el material utilizado no adsorba endotoxinas. La ausencia de factores que interfieran con la determinación.

Reactivos y Patrón de Referencia Estándar de Endotoxina USP. Lisado de Amebocitos Limulus. Reconstituir el lisado de la forma especificada. Agua para prueba de endotoxina bacteriana PEB Ácido Clorhídrico 0,1M e Hidróxido de Sodio 0,1M preparado con agua PEB.

Sensibilidad Específica El reactivo de LAL está rotulado con una sensibilidad específica determinada por el fabricante. La sensibilidad se expresa como Lambda (λ).Siendo λ la sensibilidad a la cual el reactivo LAL es capaz de coagular en presencia de Endotoxinas Bacterianas. La sensibilidad es la menor de una serie de concentraciones de endotoxina que coagula bajo condiciones específicas. Detecta hasta 0.03 UE/mL.

Confirmación de la sensibilidad declarada (λ) del reactivo Ejemplo: Sensibilidad declarada de LAL: 0.125 EU/mL Hacer la prueba con 4 concentraciones estándar por cuadriplicado. El punto final es la concentración más baja que forma coágulo. Estándar EU/mL 0.25 2λ 0.125 Λ 0.06 1/2λ 0.03 1/4λ Control negativo + -

Ensayo Cuantitativo -La concentración de endotoxina en la muestra se determina ensayando una serie de diluciones de la misma. -El punto final es la última dilución que da un resultado positivo -Para obtener la concentración de endotoxina en la muestra se multiplica la sensibilidad declarada del reactivo por el factor de dilución. 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 + - El punto final es la dilución 1:16. El factor de dilución es 16. Concentración de Endotoxina = 16x0.125UE/mL = 2UE/mL en la muestra original.

Generalmente un ensayo positivo indica la formación de un gel de coágulo sólido. Es necesario realizar controles positivos y negativos en cada ensayo para de esta forma excluir la posibilidad de falsos positivos debido a contaminación y de falsos negativos debido a la inhibición de la reacción de coagulación

Criterio de aceptación de la prueba El producto cumple con los requisitos de la prueba si la concentración de endotoxina no es mayor que la especificada en la monografía respectiva.

Criterio de aceptación Pirógenos Síntomas Fuentes Eliminación Método in vivo Método in vitro Criterio de aceptación

Referencias Bibliográficas Harrison. Principios de Medicina Interna. Mc Graw Hill Interamericana Albia Pozo. Pediatría y Medicina Interna. BVS. Bueguet Nancy, Brito Lazaro. Validacion del Método LAL para determinar endotoxinas bacterianas en soluciones inyectables. FINLAY Ediciones. The United States Pharmacopeia USP 37. Printed by National Publishing, Philadelfia, P.A.