Colecciones de mutantes por recombinación homóloga Lección 10 Colecciones de mutantes por recombinación homóloga

MUTAR UN GEN CONCRETO GEN TARGETING: ¿cómo ser capaces de causar una mutación en un gen determinado del genoma? Se aprovecha el sistema de recombinación homóloga que usan las células para reparar errores. La recombinación entre el gen diana y un fragmento de DNA que sea muy similar en secuencia sustituirá al primero por el segundo

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Aparición de extremos 3’ protuberantes PROBLEMA: REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA (HR) Formación de “D-loops” 3’ protuberantes “D-loops” “Double strand breaks” (DSB) en el DNA genómico ayudan

MUTAR UN GEN CONCRETO X Gen X original Cromosoma Gen X mutado DNA introducido en la célula ¿Cómo reconocer o seleccionar con facilidad las células en que ha ocurrido el reemplazo?

original y el que se va a sustituirlo MUTAR UN GEN CONCRETO X Gen X original Cromosoma Gen mutado DNA introducido en la célula Marcador Las células en que ha ocurrido el reemplazo tienen un marcador o gen de resistencia fácilmente detectable A ambos lados del marcador debe haber regiones de secuencia muy similar entre el gen original y el que se va a sustituirlo

“GENE TARGETING” Región a reemplazar Región de homología (basta con 40-60 pb en levaduras, > en metazoos) X X Región de homología (basta con 40-60 pb en levaduras, > en metazoos) Reemplazo Diferencias en las regiones de homología reducen la eficiencia PRERREQUISITOS: recombinación homóloga razonablemente activa (lo es mucho más en levaduras que en metazoos); se puede generar un individuo a partir de una célula (fácil uso de marcadores de selección en cultivo) USADA EN: levaduras (recombinación homóloga eficaz y unicelular) y ratones (recombinación homóloga poco eficaz pero es factible generar un individuo desde células troncales) NO USADA EN: Drosophila o C. elegans (no regenerables desde células aisladas) ni en Arabidopsis (recombinación homóloga muy poco eficaz)

Se ha eliminado el gen de interés ALGUNOS TÉRMINOS KNOCKOUT (KO): eliminar por completo todo el gen o una parte sustancial → obtendremos un mutante nulo X “Gene disruption” Se ha eliminado el gen de interés “knockout” Marcador

ALGUNOS TÉRMINOS KNOCKOUT (KO): eliminar por completo todo el gen o una parte sustancial → obtendremos un mutante nulo KNOCK-IN: reemplazar un alelo por otro. Podemos: poner un alelo con una mutación puntual (o de otro tipo) X “Gene replacement” Se ha sustituido el gen de interés por una versión modificada (“knock-in”) Variante del gen

Gen delator fusionado al gen de interés Adición de un gen delator ALGUNOS TÉRMINOS KNOCKOUT (KO): eliminar por completo todo el gen o una parte sustancial → obtendremos un mutante nulo KNOCK-IN: reemplazar un alelo por otro. Podemos: poner un alelo con una mutación puntual (o de otro tipo) poner una copia funcional pero a la que se ha añadido un delator (diana de un anticuerpo, marcador tipo GFP…) para seguir el destino de la proteína o favorecer su purificación X Gen delator fusionado al gen de interés Adición de un gen delator Delator

ALGUNOS TÉRMINOS KNOCKOUT (KO): eliminar por completo todo el gen o una parte sustancial → obtendremos un mutante nulo KNOCK-IN: reemplazar un alelo por otro. Podemos: poner un alelo con una mutación puntual (o de otro tipo) poner una copia funcional pero a la que se ha añadido un delator (diana de un anticuerpo, marcador tipo GFP…) para seguir el destino de la proteína o favorecer su purificación KNOCKDOWN: hemos reducido la expresión del gen. Puede haber sido por mutación puntual en el promotor, eliminar parte del promotor… Pero también por RNAi …

“GENE TARGETING” EN LEVADURA Ventajas en levaduras: las regiones de homología pueden ser cortas → puede bastar con un producto de PCR la recombinación homóloga se produce con buena frecuencia el organismo es unicelular → facilita la selección de los recombinantes tiene fases diploide y haploide en su ciclo vital → facilita la detección del fenotipo de los mutantes o su mantenimiento

“GENE TARGETING” EN LEVADURA Queremos eliminar este gen OPCIÓN 1: Clonamos el gen y alrededores: -Desde una genoteca de DNAg -Desde un PCR de la región

“GENE TARGETING” EN LEVADURA Cortar y reemplazar el gen por un marcador como URA3 Cortar para sacar el inserto

“GENE TARGETING” EN LEVADURA Seleccionar levaduras Ura+ Transformar con el inserto X

“GENE TARGETING” EN LEVADURA PCR OPCIÓN 2 (más popular hoy): Amplificar el MARCADOR por PCR Diseñar oligos para PCR: -Con secuencia de URA3 en 3’ -Con secuencia del gen de interés en 5’ Los 5’ deben ser suficientemente largos para permitir recombinación posterior (40-60 pb suele bastar) URA3 Gen de interés

“GENE TARGETING” EN LEVADURA Mutación en diploides Marcador X Sin fenotipo si es mutación recesiva (ventajoso si es un gen esencial)

“GENE TARGETING” EN LEVADURA Se obtienen individuos haploides Marcador Meiosis Se obtienen individuos haploides Marcador ¿Fenotipo de las células con marcador?

“GENE TARGETING” EN RATÓN + Se hace en células en cultivo Marcador Gen 1 Producto de recombinación NO homóloga: inserción fuera del gen diana Gen 1 mutado Células heterocigotas Problemas en ratón: -1)las regiones de homología deben ser largas (hace falta clonar en un vector intermedio) -2)la recombinación NO homóloga (al azar) es frecuente (hay que poder descartar con facilidad las células donde ha ocurrido: otro marcador es necesario) -3)el organismo es pluricelular (hay que regenerar individuos desde células) Individuo heterocigoto y mosaico

“GENE TARGETING” EN RATÓN 1 Región a reemplazar 2 X X Región de homología (1+2) de 6 a 14 Kb 1 y 2 pueden ser de diferente longitud (brazos largo y corto) DNA lineal es el que funciona mejor Electroporación de células con el vector para “gene targeting”: se puede actuar con facilidad sobre un gran número de células Funciona mejor en células en primera mitad de la fase S La frecuencia de recombinación NO depende del número de moléculas de vector en cada célula: lo limitante parece ser la disponibilidad de la maquinaria celular para recombinación La mayoría de las integraciones no son homólogas (en el sitio deseado) sino aleatorias (en zonas del genoma donde no están las regiones de homología): relación 102-103 a 1

INTEGRACIÓN HOMÓLOGA vs AL AZAR Integración al azar X X Sólo se integra la zona entre las regiones de homología Puede integrarse cualquier parte del DNA lineal

SELECCIONAR CONTRA LA INTEGRACIÓN ALEATORIA Gen de partida 1 2 3 4 5 6 7 Interrumpe el exón 3 No debiera incorporarse en la integración homóloga Vector para mutar el gen de partida por recombinación homóloga 1 2 3 4 5 6 neoR HSV-tk Resistencia a neomicina o a G418 Sensibilidad a Ganciclovir o a FIAU Región de homología Selección doble (positivo-negativa): -agente selectivo positivo (vg. neoR) a favor de células que han incorporado DNA del vector -agente selectivo negativo (vg. HSV-tk) contra células con integración al azar

No ha habido integración POSIBLES RESULTADOS No ha habido integración Vector sin integrar (acaba perdiéndose) Células sensibles a Neomicina o G418 (inhiben síntesis proteínas) DNAg intacto

POSIBLES RESULTADOS No ha habido integración Células sensibles a Neomicina o G418 Integración al azar Integración en sitio no homólogo, PUEDE entrar también el gen HSV-tk Células resistentes a Neomicina o G418 y sensibles a ganciclovir o FIAU (son fosforilados por HSV-tk y dan productos que inhiben DNApol)

POSIBLES RESULTADOS No ha habido integración Células sensibles a Neomicina o G418 Integración al azar Células resistentes a Neomicina o G418 y sensibles a ganciclovir o FIAU Integración dirigida Integración en sitio homólogo, NO entra el gen HSV-tk Células resistentes a Neomicina o G418 e insensibles a ganciclovir o FIAU (al no haber HSV-tk no dan productos fosforilados)

PRIMERO EN CÉLULAS El doble sistema de selección permite eliminar la mayoría de las células sin interés. Ultima comprobación por Southern Blot o PCR porque puede haber integraciones al azar en las que NO entre COMPLETO el marcador HSV-tk

Región de homología de varias Kb CONFIRMACIÓN POR PCR Región de homología de varias Kb Sólo hay producto de PCR si se ha producido la inserción correctamente. PROBLEMA: dado el tamaño de las regiones de homología, el producto de PCR puede ser demasiado largo para salir fácilmente (no suele haber ese problema en levaduras)

COMPROBACIÓN POR SOUTHERN X A B sonda d l AA AB d d + l “Southern blot” con sonda del gen

PASAR A RATONES Se inyectan en un blastocisto Células ES con la recombinación. Vienen de un individuo de pelaje normal (A/A) Se inyectan en un blastocisto Blastocisto de un individuo de pelaje albino (recesivo frente a normal) a/a Blastocisto con dos tipos de células: A/A; KO/+ y a/a; +/+

PASAR A RATONES Los descendientes pueden ser mosaicos Implantar los embriones quiméricos Los descendientes pueden ser mosaicos Células A/A; KO/+ Células a/a; +/+

OBTENER RATONES KO/+ X A; KO A; + a; + Gametos: Se cruzan los ratones quiméricos con hembras albinas Habrá individuos de pelaje normal si en el mosaico parte de las gónadas venían de las células ES Dos posibles genotipos: A/a; KO/+ y A/a; +/+ Se distinguen por PCR o “Southern” (o algún marcador en la inserción) X A; KO A; + a; + Gametos: A/A; KO/+ a/a; +/+

Ratones heterocigotos para el KO OBTENER RATONES KO/KO X A/a; KO/+ Ratones heterocigotos para el KO 1/4 son KO/KO y 1/2 son KO/+ Se distinguen por PCR, Southern o algún marcador adicional presente en la adición ¿Fenotipo de los KO/KO?

POSIBLES FENOTIPOS DEL KO/KO Claro (IL-6 KO más pesado) Letal Sutil (Cdk2 KO estéril) Claro (IL-6 KO más pesado) ¿El gen no hace nada en las condiciones probadas? ¿Hay otros genes que pueden suplir su falta? ¿El KO es realmente un KO? Ninguno:

Exón 3 da un dominio esencial para la actividad de la proteína UN KO NO TAN KO 1 2 3 4 5 6 neoR Posibles complicaciones: -hay transcripción de los exones no alterados desde regiones promotoras crípticas -aparecen tránscritos que dejan fuera la secuencia con el marcador introducido -transcripción del gen neoR es con un promotor fuerte y se extiende hacia los exones posteriores QUE en todos esos casos la proteína resultante tENGA alguna actividad Soluciones: -disponer la inserción en una zona esencial de la proteína: proteínas sin ella no funcionarán -transcripción del marcador en sentido contrario a la del gen 1 2 3 4 5 6 neoR Exón 3 da un dominio esencial para la actividad de la proteína

OTRO PROBLEMA CON LOS KO ¿Y si quiero hacer KO de varios genes? Marcador Gen 1 Gen 2 Marcador Gen 1 Gen 2 PROBLEMA 1: ¿cómo selecciono las células con los genes 1-KO y 2-KO frente a las que sólo tienen gen 1-KO si el marcador es el mismo?

OTRO PROBLEMA CON LOS KO ¿Y si quiero hacer KO de varios genes? Marcador Gen 1 Gen 2 PROBLEMA 2: al ser igual el marcador puede recombinar con el gen 1-KO en vez de con el gen 2

OTRO PROBLEMA CON LOS KO ¿Y si quiero hacer KO de varios genes? Necesito un marcador distinto para cada uno Marcador 1 Gen 1 Marcador 2 Gen 2 PERO en el caso de genes que pertenecen a familias multigénicas puede ser preciso obtener KO de muchos genes en un individuo: puede no haber suficientes marcadores diferentes ¿Y si pudiera QUITAR de algún modo el marcador tras usarlo en la selección para dejar el gen con una delección? → me bastaría con un único marcador

UN PROBLEMA RELACIONADO AL HACER UN “KNOCK-IN”

MUTACIONES MÁS SUTILES: “KNOCK-IN” “Gene replacement” o “knock-in” Cambio de un aa Quiero ver el efecto de cambios pequeños en la secuencia de un gen sobre su función: NO ME INTERESA QUE QUEDEN MARCADORES POR MEDIO DEL GEN: ¿Y SI LOS PUDIERA QUITAR? (problema similar al de antes) SOLUCIÓN CLÁSICA PARA QUITARLOS:

MUTACIONES MÁS SUTILES Cambio de un aa “Gene replacement” o “knock-in” Dos tandas de recombinación homóloga: “Tag” Vector 1 Los dos marcadores entrarán juntos He insertado dos marcadores (uno + y otro –) en el gen. Selecciono las células por tener el marcador + “Exchange” Vector 2 Células insensibles a ganciclovir o FIAU (no tienen tk) Con el marcador – selecciono las células que han perdido los marcadores Se cambian los marcadores por el exón con secuencia cambiada ¿SE PODRÍAN QUITAR MÁS FACILMENTE?

MANERAS MÁS FÁCILES DE HACERLO

SISTEMA Cre-lox Cre: enzima de recombinación para integrar el fago P1 en sitios loxP Repetición invertida Espaciador Repetición invertida ATAACTTCGTATA ATATGCTTCAATA GCATACAT TATACGAAGTTAT TATTGAAGCATAT CGTATGTA Sitio loxP (34 pb) Puntos de corte por Cre Orientación del sitio loxP

SISTEMA Flp-FRT Flp (“flipase”): enzima de recombinación del plásmido 2µ de levadura Repetición invertida Espaciador Repetición invertida GAAGTTCCTATtC CATATCCTTGAAG TCTAGAAA GtATAGGAACTTC CTTCAAGGATAAG AGATCTTT Sitio FRT básico (34 pb) Hay variantes con la secuencia adicional GAAGTTCCTATTCc en 5’ Puntos de corte por Flp Orientación del sitio FRT Parece menos activo que el Cre-lox en ratones por su menor temperatura óptima de actuación (30ºC frente a 37ºC). Pero se han obtenido variantes que ya tienen actividad similar

SISTEMA Cre-lox Orientación del sitio loxP Sitio loxP (34 pb) ATAACTTCGTATA ATATGCTTCAATA GCATACAT TATACGAAGTTAT TATTGAAGCATAT CGTATGTA Orientación del sitio loxP Sitios loxP en igual orientación Actuación de Cre: se pierde la secuencia entre los sitios loxP Puede ocurrir la reacción inversa Actuación de Cre: inversión del segmento intermedio Sitios loxP en orientación invertida Exón

USO DEL SISTEMA Cre-lox 1 2 3 4 5 6 7 “Floxed gen”: con sitios loxP añadidos (gen normal) 1 2 6 7 Tras expresar Cre se pierde la región entre los sitios loxP (gen mutado) Las células deben tener en alguna otra posición del genoma el gen Cre bajo algún sistema de expresión inducible: sólo cuando se induzca se producirán las deleciones UTILIDAD PARA QUITAR MARCADORES:

MARCADORES FUERA CON Cre-lox Cambios sutiles en un gen Cambio de un aa Sitio loxP 2 Sitio loxP DT-A: fragmento A toxina difteria: si se incorpora la célula muere (selecciona células con recombinación no homóloga) Los marcadores y el nuevo exón 2 han entrado A LA VEZ Queda una mutación “limpia”, sin los marcadores. Sólo queda un sitio loxP y en un intrón Aquí se eliminan los marcadores en las células en cultivo al expresar Cre Con Cre se pierden los marcadores OTRA UTILIDAD:

MUTANTES CONDICIONALES CON Cre-lox ¿Qué problemas causa la falta de este gen? ¿Tiene la misma función en todos los órganos y momentos? KO/+ X KO/KO † +/+ Sería útil poder hacer que el KO sólo apareciera en homocigosis en un individuo cuando quisiéramos: MUTANTE CONDICIONAL

MUTANTES CONDICIONALES Células con Cre en otro locus Sitio loxP 3 Exón importante Efectos al expresar Cre: Un knockout constitutivo Para mutantes condicionales: dan ratones con el exón 1 del gen “floxed”: funciona NORMAL Mueren en presencia de FIAU o gangiclovir Cuando Cre se exprese en ese ratón adulto se producirá la mutación: PÉRDIDA DEL EXÓN 1

¿CÓMO INDUCIR Cre A VOLUNTAD? Promotor específico En células X o momento t Cuando el promotor está activo aparece Cre Mutación en presencia de Cre Gen “floxed”: funciona normal Gen mutado Cre Promotor Virus con Cre En células infectadas Cuando llegan los virus aparece Cre OTRA OPCIÓN: inducir la aparición de Cre al tratar con algo al individuo → tendremos aún más control temporal

ACTIVACIÓN INDUCIBLE DE Cre Promotor inducible En células con TF activo TF Activo Inactivo Inductor Sistema Tet clásico TF activo → Cre → Mutación TF inactivo → NO HAY Cre PROBLEMA: para que no haya mutación hay que estando dando Tet al animal → ¿NO SERÁ DEMASIADO?

ACTIVACIÓN INDUCIBLE DE Cre Promotor inducible En células con TF activo TF Activo Inactivo Inductor Sistema Tet reverso TF inactivo → NO HAY Cre rTA: proteína bacteriana tTA modificada TF activo → Cre → Mutación Sólo hay mutación al dar Tet al animal

ACTIVACIÓN INDUCIBLE DE Cre Controlar la localización subcelular de Cre Cre queda en el citoplasma (no puede actuar) Cre pasa al núcleo y puede actuar Dominio de unión del receptor de estrógenos: NO se une a estrógenos naturales Tamoxifeno o derivados: esteroides no naturales

RESUMEN: ACTIVACIÓN DE CRE Ratón con el gen “floxed” Cre Virus con gen Cre Cre Ratón con el gen Cre X Mutación en presencia de Cre activo POSIBLE PROBLEMA El ratón es un mosaico para la mutación porque la eficiencia de Cre no suele ser del 100%

MUTANTES CONDICIONALES SOX9 es un TF activo en muchos procesos y etapas del desarrollo embrionario. Activación de Cre por un promotor específico de mesénquima de los miembros muestra su papel en el desarrollo del esqueleto de los miembros pero no afecta al desarrollo inicial de los miembros

Copia funcional del gen IMPORTANTE CONTROL Ratón wt Ratón mutante Copia funcional del gen ¡! ¿? ¿SE REVIERTE EL FENOTIPO MUTANTE AL AÑADIR UNA COPIA FUNCIONAL DEL GEN: COMPLEMENTACIÓN?

UN PROBLEMA: EL “FONDO GENÉTICO” -Hay varias cepas disponibles de ratones de laboratorio 129 C57BL/6 DBA BALB/c … -Típicamente, todos los individuos de una cepa son genéticamente idénticos -Pero no lo son los de distintas cepas y, en consecuencia, diferentes cepas suelen tener diferencias fenotípicas -De no todas las cepas se tienen cultivos de células ES, los más comunes proceden de la cepa 129 -La cepa 129 es problemática para ciertos estudios por lo que en muchos casos se han cruzado los transgénicos quiméricos obtenidos con hembras de otras cepas más útiles, Y AQUÍ SURGEN LOS PROBLEMAS

UN PROBLEMA EL “FONDO GENÉTICO” 1/2 heterocigotos para el KO 1/2 sin el KO KO Todos los individuos de la F1 son heterocigotos para todos los loci que difieran entre ambas cepas: genéticamente idénticos, salvo para el KO Lo normal es que el fenotipo causado por el KO sólo se detecte en homocigosis: hay que cruzar entre si individuos con el alelo KO

UN PROBLEMA EL “FONDO GENÉTICO” Como consecuencia de la recombinación diferentes individuos de la F2 tendrán diferentes combinaciones de alelos de ambas cepas: no serán genéticamente iguales y habrá cierta variabilidad en sus fenotipos PRIMER PROBLEMA: ¿podremos notar el efecto causado por la homocigosis del KO bajo ese ruido de fondo?

UN PROBLEMA: EL “FONDO GENÉTICO” alelos 129 alelos C57 La recombinación entre dos loci es tanto más probable cuanto más alejados estén entre si CONSECUENCIA: los individuos de la F2 KO/KO y los +/+ no sólo difieren en ese locus sino que los KO/KO también tenderán a ser homocigotos para los alelos de alrededor procedentes de la cepa 129 y los +/+ para los de alrededor procedentes de la otra cepa POR TANTO, EL SEGUNDO PROBLEMA ES: ¿cómo estar seguros de que el fenotipo observado se debe al KO y no a efectos de alelos de otros loci de alrededor?

¿SOLUCIONES? X Varias generaciones de retrocruzamiento con la otra cepa de ratones En el esquema C las zonas rojas cada vez serán mayores: cada vez quedarán menos alelos de la cepa 129 y los individuos irán siendo más uniformes genéticamente En el esquema D cada vez será más pequeña la zona alrededor del locus del KO con probabilidad apreciable de tener alelos 129 PROBLEMAS: -1) cada generación de retrocruzamiento supone tiempo y trabajo -2) no se puede descartar que sigan quedando alelos 129 cerca del locus del KO MEJOR SOLUCIÓN: que las células ES vengan de la cepa donde se estudiará el fenotipo: no hay necesidad de cruzar