Laboratori de Citogenètica Molecular Pre-analítica en el procesamiento de muestras para hibridación in situ (ISH): ¡Esto no va a hibridar nunca! Dra Marta Salido Laboratori de Citogenètica Molecular Servei de Patologia Hospital del Mar 24 de Febrero 2017

FISH EN NEOPLASIAS NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS 1990 BCR/ABL 1993-95 PML/RARA, AML1/ETO, MLL… 1993 +12 LLC 1993-96 MYC, BCL2, BCL6 TUMORES DE MAMA 1992 HER2 1998 FDA Trastuzumab Pathvysion SARCOMAS 1995-97 EWSR1 FUS CHOP DDIT3 MDM2 MELANOMAS 2003 Genes candidatos distinguir melanomas vs nevus 2009 Kit RREB1, MYB, CCND1, CEP6 TUMORES DE VEJIGA 2000 +3,+7,+17,9p21 2001 FDA UroVysion recaidas 2005 FDA UroVysion diag hematuria FISH EN NEOPLASIAS TUMORES PULMONARES 2007 ALK-EML4 2009 MET 2011 FDA Crizotinib 2012 ROS1, RET 2013 FDA ALK kit TUMORES CEREBRALES 1998 1p-/19q- ODG 2006 Uso en rutina TUMORES GÁSTRICOS Y UEG 1997 HER2 2010 FDA Trastuzumab Pathvysion

FISH EN MUETRAS PARAFINADAS Herramienta útil para el diagnóstico patológico Permite localizar la alteración genética en una célula específica o en regiones de un tejido, lo que permite estudiar alteraciones en 1 única célula a diferencia de los estudios en DNA que mezclan DNA de cientos de células distintas. En comparación con la técnica de FISH en muestras en suspensión, la técnica de FISH en parafina: Técnicamente más laboriosa Variabilidad en el resultado elevada causada por el procesamiento pre-analítico de las muestras Interpretación limitada por el solapamiento y rotura de núcleos

FACTORES QUE AFECTAN EL ÉXITO DE UN FISH Artefactos morfológicos por manejo de la muestra en fresco Condiciones de fijación de la muestra en fresco Tipo de Tejido Grado de fibrosis Antigüedad de la muestra parafinada Corte del bloque: portaobjetos pretratados, grosor Tiempo que tenemos almacenado el corte para FISH Fase Pre-analítica Desparafinización Pretratamiento de la muestra Digestión con pepsina/proteasa Condiciones de desnaturalización/hibridación Lavados de post-hibridación Fase Analítica

FASE PRE-ANALÍTICA. MUESTRAS PARAFINADAS Obtención de la muestra Fijación Formol 4% Inclusión Microtomía 3-4 µm Artefactos morfológicos Tiempo de isquemia fría Tiempo en función del tamaño de la biopsia (6-48h) Sobre o infra fijación Evitar uso de fijadores mercuriales y ácidos Superposición de núcleos

ARTEFACTO MORFOLÓGICO FISH ALK split 100X En la HEOS se observa una infiltración en mucosa bronquial. Destaca artefacto en las células por compresión con la pinza del broncosopio. La imagen de FISH nos muestra un DAPI en el que los núcleos no pueden definirse aisladamente y los hace no valorables. Podríamos pensar que ha sido un error de técnica de FISH y repetirlo en nuevo corte pero volvería a ser no valorable. Infiltración de la mucosa bronquial por ADC Artefacto por compresión de la pinza del broncoscopio Ausencia de núcleos bien definidos

ISQUEMIA FRÍA Y FIJACIÓN Isquemia fría: Un retraso en la fijación provoca acidosis tisular y degradación: Afecta a la correcta preservación de DNA y RNA Realizar la fijación lo antes posible: 1-3 horas Fijación: Reacciones químicas que dan lugar a enlaces entre proteínas y ácidos nucleicos Fijador recomendado: Formol al 10% tamponado Evitar el uso de fijadores mercuriales, pícricos y alcohólicos Tiempo de fijación 6-48 horas Una fijación prolongada afecta la calidad del DNA: Degradación DNA Tiempo de isquemia: Período que transcurre entre exéresis y el inicio de la fijación. Formol a una concentración del 10% tamponado con fosfato a pH neutro, que contiene un 4% de formaldehído La fijación genera puentes hidroximetilos entre las proteínas quedando emmascarados algunos epítopos. Penetran tb en las proteína nucleares y ácidos nucleicos pudiendo modificar nucleótidos UNIÓN ENTRE GRUPOS AMINOS (NH2) DE LAS PROTEÍNAS Y LOS FIJADORES ALDEHIDOS

RUIDO DE FONDO-FIJACIÓN O TIPO TUMORAL? FISH ALK split

NÚCLEOS DESNUDOS-FIJACIÓN O TIPO DE NÚCLEO TUMORAL? La HEOS nos muestra los núcleos con cromatina de tipo vesicular, desplazada a la periferia por sobrefijación de la muestra. La imagen del FISH muestra el mismo patrón de cromatina con la tinción DAPI. Podríamos pensar que ha sido un error de técnica en la que hemos digerido demasiado el tejido y decidir repetir un FISH que volvería a salir igual. FISH ALK split

RUIDO DE FONDO-FIJACIÓN Y TIPO DE TEJIDO 100X Biópsia ADC de pulmón

RUIDO DE FONDO-FIJACIÓN Y TIPO DE TEJIDO 100X Biópsia de carcinoma de próstata

Ganglio100X

Monet Col Lombarda

PROCESADO PARA FISH HE IHQ FISH Integración de datos Corte de sección para FISH HE IHQ FISH Integración de datos

Introducción a las técnicas de hibridación in situ CORTE DE SECCIONES PARA FISH Cortes de tejido de 3-4µm en portaobjetos silanizados o con carga positiva Evitar que se desprenda el tejido Estufar: eliminar exceso y tb que se adhiera mejor al porta (min 1h a 65ºC) No guardar en nevera sin estufar Incubación a temperatura elevada Estufa 65°C (1h’ – overnight) Adecuar las condiciones de preservación del corte para FISH en función del estudio

CORTES DE SECCIONES PARA FISH Bloque parafina Núcleo célula tumoral Grosor de la sección para FISH 4µm Diámetro 6µm

CORTES DE SECCIONES PARA FISH Elevado número de núcleos con pérdida de señales: limitación para estudio de deleciones Heterogeneidad de número de copias causada por el corte

Solapamiento de núcleos ADC de pulmón 60X

ADC de pulmón 60X

CORTES DE SECCIONES PARA FISH Sonda de Doble Fusión para detección de reordenamientos Es necesario establecer Puntos de corte

CORTES DE SECCIONES PARA FISH-ALK Célula tumoral disómica con reordenamiento de ALK. La probabilidad de ver la señal separada en 2 dimensiones es sólo de un 25%!! Núcleos polisómicos con muchas copias de ALK reordenadas: mayor probabilidad de detección que en un núcleo disómico con una única copia reordenada La alta polisomía de ALK en casos negativos: falsos positivos It is obvious that FISH analysis for ALK rearrangements is not a FISH application ‘for beginners’….. Bubendorf et al., Acta citológica, 2012

PROCESADO PARA FISH HE IHQ FISH Integración de datos Corte de sección para FISH HE IHQ FISH Integración de datos Selección del área tumoral

SELECCIÓN DEL ÁREA TUMORAL Zonas con abundante necrosis, no hibridación con sonda FISH. FISH ALK positivo FISH ALK split

SELECCIÓN DEL ÁREA TUMORAL Visualizar el caso conjuntamente (patólogo-citogenetista) para la selección del área tumoral. Mejora del rendimiento de la técnica FISH Cantidad de sonda Valoración células tumorales VENTANA Virtuoso image and workflow management software  Cedida por Dra. Lara Pijuan

3+ R=6,6 FISH POSITIVO 2+ R=4,4/2,55=1,7 FISH NO CONCLUYENTE IHQ HER2

CONCLUSIONES Conocer y controlar la importancia del procesamiento pre-analítico aumenta el rendimiento de la técnica FISH Conocerlo nos permite ahorrar esfuerzos y sonda (repeticiones) en la fase analítica Controlarlo nos permite mejorar el análisis de los resultados de FISH

Introducción a las técnicas de hibridación in situ Gracias!!