Precipitación y Concentración de DNA JA Cardé, PhD Biol 4019 - Lab Biología Celular Molecular Universidad de Puerto Rico-Aguadilla

Objetivos Purificar ácidos nucleicos que se encuentran en solución, precipitándolos Utilizar correctamente un espectrofotómetro para medir absorbancia a largos de onda de 260 nm y 280 nm. Determinar concentración y pureza de ácidos nucleicos.

Introducción La técnica de precipitación etanólica tiene como fin: Remover residuos de cloroformo y/o fenol. Resuspender los ácidos nucleicos en pequeños volúmenes de agua destilada  o de TE pH 8.0 (Tris-HCL y EDTA) PLT concentrarlos.  

Introducción El DNA se puede precipitar de solución acuosa para remover residuos de la extracción añadiendo una concentración moderada de cationes monovalentes (sales, salting out) volumen apropiado de etanol (constante dieléctrica) centrifugación para recobrarlo temperaturas entre -20 ˚C y -70 ˚C********** Se resuspende en un pequeño volumen de algún amortiguador apropiado, (concentrado) Técnica rápida y eficiente con cantidades pequeñas de DNA.  ******** asignacion.. Cual es la importancia del frio?????

Introducción … Purificación: Luego de la precipitación hay que remover los residuos del etanol mismo. Precencia de etanol en el DNA o RNA  interfiere con las reacciones enzimáticas Con las electroforesis con geles de agarosa. Además, los residuos de etanol dificultan el proceso de resuspender los ácidos nucleicos en solución.  (PORQUE? = CD)    Constante Dieléctrica

Concentración y Pureza: Espectrofotómetro Etimadas utilizando geles de agarosa, o el espectrofotómetro.   Espectrofotómetro: instrumento que estima la cantidad de luz que es absorbida (retenida) por la molécula en estudio (figura 1a). Muestra colocada en una cubeta de cuarzo o plástico. Rayo de luz de un largo de onda particular pasa a través de la cubeta hasta un detector (fototubo).

Concentración y Pureza: Espectrofotometro Instrumento reporta la lectura en absorbancia (o densidad óptica, OD). OD- es calculado utilizando la siguiente fórmula: A = logIo/I Donde A = absorbancia, Io = intensidad de la luz entrando a la cuveta,   I = intensidad de la luz que alcanza al detector 

Absorbancia   Factores que afectan la absorción de la luz de una solución: Concentración Solvente utilizado La distancia que viaja el rayo de luz La característica de la cubeta.     Para calcular la concentración de DNA o RNA en solución Determinar la absorbancia de una dilución a un largo de onda de 260 nm (OD260).   Usar el siguiente factor de conversión: 50 µg/ml de DNA de doble hebra refleja un O.D. de 1 a 260 nm 37 µg/ml de DNA de hebra sencilla refleja un O.D. de 1 a 260 nm 40 µg/ml de RNA de hebra sencilla refleja un O.D. de 1 a 260 nm

Concentración Ejemplo:    La ecuación para determinar la concentración del DNA es:     Concentración de DNA (µg/ml) = (OD260) x (factor de dilución) x 50 µg de DNA/ml 1 Unidad de OD260 Ejemplo:  10 µl de DNA se obtienen de una muestra de DNA con un volumen total de 100 µl. Se diluyen en la cuveta con 390 µl de agua. Factor de dilución= VolT/ VloI = 400 / 10 = fd = 40 Se leen en el espectrofotometro ABS 260 nm: OD260 = 0.205.   Factor de dilucion – da una idea de cuan concentrado o diliuido esta una muestra Se calcula como volumen final / volumen inicial o vol total / volumen diluido Ej. Tomo 1 ul de A(muestra) y lo anado a 4 ul de B (diuyente) = 5/1: fd= 5 Tomo 2ul de A en 8 ul de B = 10/2 fd = 5 Tomo 5 ul de A y lo anado a 995 ul B: FD = 1000/5

Concentración Lectura OD260 = 0.205. Factor de dilución= VolT/ VloI = 400 / 10 = fd = 40 50ug de DNA/ml = dado para DNA DS Concentración de DNA (µg/ml) = (0.205) x (400) x 50 µg de DNA/ml  = 410 µg/ml 10       1 Unidad de OD260   Para estimar la concentración TOTAL de DNA en la muestra: Se multiplica la concentración en µg/ml por el volumen de la muestra.       410 µg  x  0.09 ml* = 36.9 µg /ml  * Comenzamos con 100 µl de la muestra - 10 µl utilizados para la lectura de absorbancia = 90 µl; 90 µl / 1x106 ul/ml = Factor de dilucion – da una idea de cuan concentrado o diliuido esta una muestra Se calcula como volumen final / volumen inicial o vol total / volumen diluido Ej. Tomo 1 ul de A(muestra) y lo anado a 4 ul de B (diuyente) = 5/1: fd= 5 Tomo 2ul de A en 8 ul de B = 10/2 fd = 5 Tomo 5 ul de A y lo anado a 995 ul B: FD = 1000/5

Pureza: Abs260/Abs280 Se necesita determinar Abs a OD280. Razón entre la lecturas de OD260/ OD280 es utilizado para estimar la pureza de los ácidos nucleicos. Preparación de DNA debe tener un radio OD260/ OD280 de 1.8 y el RNA un radio de 2.0. Radio menor de 1.8 sugiere proteínas que contaminan la muestra de DNA. Se recomienda extracción Fenol/Clorof Y mayor de 1.8?    Ejemplo:  Si el OD260 de una muestra de DNA es de 0.205 y el OD280 es de 0.114, el radio OD260/ OD280 será de 1.8. ¡Un DNA puro!  

Materiales Agua Destilada Baño de Agua Cuvetas Plasticas Espectrofotómetro Etanol 70% Etanol 95% Microcentrífuga Micropipetas y puntas Papel Kimwips Vortex

Protocolo: Precipitación Etanólicas   1) Obtenga el microtubo que contiene el DNA con etanol al 95 %.  Centrifugue por 10 minutos a 12,000 rpm y descarte el sobrenadante. 2)  Añada 300 µl de etanol al 70 % frío y mezcle utilizando el vortex. 3)  Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm y descarte el sobrenadante. 4) Invierta el microtubo con la tapa abierta sobre papel toalla. Déjelo reposar por 5 minutos.

Protocolo: Precipitación Etanólicas   5)  Incube el microtubo (tapa abierta) por 10 minutos a 65 ºC. Asegúrese de remover todo el etanol. 6)  Añada 50-200 µl de agua destilada previamente esterilizada. La cantidad de agua va a depender del precipitado presente en el microtubo. 7) Incube el microtubo (tapa cerrada) por 5-30 minutos en un baño de María a 65 ºC. Asegúrese de que el DNA se encuentra resuspendido completamente antes de proseguir.

Concentración y Pureza 1) Añada 1000 µl de agua destilada y previamente esterilizada a una cuveta plástica para espectrofotómetro. Este será su blanco. 2)  En otra cuveta de plástico, mezcle 10 µl de la solución de DNA (paso A-7) y 990 µl de agua destilada previamente esterilizada. 3)  Utilice el blanco para calibrar el espectrofotómetro.

Concentración y Pureza 4)  Coloque la cuveta plástica del paso B-2 en el espectrofotómetro y obtenga las lecturas de absorbancia a 260 nm y 280 nm. 5)  Estime la concentración y pureza del DNA de su muestra.  6)  Rotule correctamente su microtubo y guárdelo  a – 20 ºC hasta el próximo laboratorio.

Cálculos y Preguntas Preguntas   Utilizando las fórmulas aprendidas en este módulo, estime la concentración y pureza del DNA que se encuentra en solución. Preguntas  ¿Cual es el rol del etanol en la precipitación de los ácidos nucleicos? Explique su respuesta haciendo referencia a la estructura y enlaces de las macromoléculas. Si el radio OD260/ OD280  de su muestra es menor de 1.8, su muestra de DNA se encuentra contaminada con proteínas. ¿Qué ocurrió en el procedimiento que afectó los resultados? ¿Qué debe hacer para mejorar estos resultados? Como parte de su trabajo en un laboratorio, usted extrae DNA de un organismo dado. Luego de precipitar el DNA usted debe estimar la concentración del mismo. Cuando va a utilizar el espectrofotómetro se percata de que esta dañado. ¿Cómo usted puede estimar la concentración y pureza de su muestra de DNA? Explique el método utilizado y por qué lo utiliza. ¿Puede el DNA ser precipitado utilizando isopropanol? De poder ser utilizado, mencione las ventajas y desventajas que tiene el uso del mismo. 5El DNA puede ser resuspendido con agua destilada o TE. Mencione las ventajas y desventajas de utilizar agua destilada versus TE y lo contrario.  

Para ver DNA Extraction DNA Extraction – Agriculture DNA Extraction - Slideshare