LOS AMINOÁCIDOS Carbono α quiral. 2 LOS AMINOÁCIDOS.

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1 LOS AMINOÁCIDOS Carbono α quiral

2 2 LOS AMINOÁCIDOS

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4 ÁcidoBase

5 LOS AMINOÁCIDOS

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7 El ácido glutámico es un aminoácido que se encuentra de forma natural en alimentos ricos en proteínas, como la carne y los productos lácteos. En su forma ionizada (glutamato) se emplea como potenciador del sabor en comidas preparadas, en algunos tipos de comida china, y en determinadas salsas y sopas. Conociendo los valores de pK, defina el rango de pH en el cual el ácido glutámico se encuentra cómo glutamato.

8 LOS AMINOÁCIDOS La glicina, además de estar presente en muchos alimentos, se utiliza como un aditivo potencializador del sabor. Una solución 0.25M de glicina ha sido adicionada a dos tipos de alimentos: una carne normal (pH 7.2) y una carne madurada (pH 5.1). En cuál de los dos alimentos se encontrará una mayor cantidad del aditivo en forma ácida ionizada?

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10 PÉPTIDOS

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13 Dibujar el dipeptido Glu-Phe (EF) Dibujar el dipeptido Glu-Tyr (EY)

14 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

15 Hélices α

16 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS Láminas β

17 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

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19 PUENTES DISULFURO

20 DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

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22 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS Estructura primaria, secundaria y terciaria de la hepsidina, una proteína intestinal que impide la absorción de hierro

23 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS Representación esquemática de la estructura de la albúmina de huevo

24 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS LA ESTRUCTURA DE LA INSULINA

25 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

26 DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DESNATURALIZACIÓN DE LA ALBÚMINA DE HUEVO

27 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS DÓNDE ENCONTRAR LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA? Protein information resources: http://pir.georgetown.edu/http://pir.georgetown.edu/ Protein Data Bank: http://www.pdb.org/http://www.pdb.org/

28 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

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33 TRABAJO INDEPENDIENTE Investigar una proteína de interés en alimentos, utilizando la base de datos, encontrar: secuencia, estructura, pI, y grado de homología con la hemoglobina humana.

34 CÓMO CONOCER LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA? Primero se debe purificar…cómo??

35 CÓMO CONOCER LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA? CROMATOGRAFÍA Muestra Cromatografía líquida en columna Tswett, 1903

36 CÓMO CONOCER LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA? QUÉ PASA AL INTERIOR DE UNA COLUMNA DE CROMATOGRAFÍA?

37 CÓMO CONOCER LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA? DE QUÉ ESTA COMPUESTO EL SOPORTE EN UNA CROMATOGRAFÍA? ADSORCIÓN Sílica INTERCAMBIO IÓNICO Resina EXCLUSIÓN Gel

38 CÓMO CONOCER LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA? DE QUÉ ESTA COMPUESTO EL SOPORTE EN UNA CROMATOGRAFÍA? PAPEL Celulosa

39 CÓMO CONOCER LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA? CONSULTAR Centrifugación diferencial de proteínas Precipitación (salting-in, salting-out) Desolvatación de proteínas Cromatografía (adsorición, intercambio iónico, en papel, permeación en gel) Electroforesis en gel de poliacrilamida

40 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PROTEÓMICA

41 Proteina extracelular Proteina intracelular PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

42 PROTEÍNAS EXTRACELULARES 1.Separar el medio liquido de los sólidos (celulas) (filtración, decantacion) 2.Separar los productos de interés del medio liquido 3.Refinamiento y caracterización de los productos de interés PROTEÍNAS INTRACELULARES 1.Extraer el producto de interes desde el medio solido (celulas) al medio liquido 2.Separar los productos de interés del medio liquido 3.Refinamiento y caracterización de los productos de interés PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

43 Productos extracelulares: Separación del medio líquido de las celulas Decantación Filtración PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

44 Decantación: Proceso industrial Productos extracelulares: Separación del medio de las celulas PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

45 Filtración: Proceso industrial (filtro prensa) Productos extracelulares: Separación del medio de las celulas PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

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47 Cómo romper las membranas celulares?

48 Extracción sólido/liquido Agitación, Maceración Temperatura (??) Ultrasonido PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

49 49 EXTRACCIÓN CON ULTRASONIDO 20 KHz

50 Separar las proteínas del medio liquido PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

51 Separar las proteínas del medio liquido ¿Por qué precipitan las proteinas? PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

52 Refinamiento y caracterizacion Cromatografia Fase móvil Fase estacionaria Producto de interés Preparativo - manual Fase móvil Fase estacionaria PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

53 QUÉ PASA AL INTERIOR DE UNA COLUMNA DE CROMATOGRAFÍA? PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

54 DE QUÉ ESTA COMPUESTO EL SOPORTE EN UNA CROMATOGRAFÍA? ADSORCIÓN Sílica INTERCAMBIO IÓNICO Resina EXCLUSIÓN Gel PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

55 DE QUÉ ESTA COMPUESTO EL SOPORTE EN UNA CROMATOGRAFÍA? PAPEL Celulosa PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

56 Refinamiento del producto final Solvente Bomba Inyector Columna Detector Registro de señal Respuesta Manual Automatico – HPLC (Cromatografia Liquida de Alta Resolucion) PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

57 HPLC HPLC – High Performance Liquid Chromatography - High Pressure Liquid Chromatography UV/Vis: (aromaticos 280 nm) Espectrometria de Masas: Peso molecular 280 nm PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

58 ESPECTROMETRIA DE MASAS - MS

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60 29 MS y MS/MS ESPECTROMETRIA DE MASAS - MS

61 LKTLKT Fragmentos trípticos Digestión con proteasas ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

62 Secuencia Tag (MS/MS-spectrum) Figura 3. Espectro MS/MS generado de ESI-Ion Trap AA CodesMassAA Codes Mass GlyG57.021464AspD115.02694 AlaA71.037114GlnQ128.05858 SerS87.032029LysK128.09496 ProP97.052764GluE129.04259 ValV99.068414MetM131.04048 ThrT101.04768HisH137.05891 CysC103.00919PheF147.06841 LeuL113.08406ArgR156.10111 IleI113.08406TyrY163.06333 AsnN114.04293TrpW186.07931 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

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64 SECUENCIADOR DE PROTEINAS

65 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

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67 Electroforésis Roolpi, 2002 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

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69 69 Como se producen los rayos X? Ánodo Fe, Cu, Mo Cátodo Tungsteno L-K = Kα M-K= Kβ Mo: 0.7107 Cu: 1.5418 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

70 70 Como se producen los rayos X? ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

71 71 Radiación sincrotrón Como se producen los rayos X? ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

72 72 Electrones del material vibran a una frecuencia = frecuencia Rx Emiten (dispersan) parte de la energía a una longitud de onda caracteristica Dispersión constructiva o frentes de onda en fase (difraccion) Ecuación de Bragg ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

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75 HCl, 18 horas (digestión ácida)

76 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

77 Análisis total de proteínas Roolpi, 2002 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

78 Análisis total de proteínas ANÁLISIS DE PROTEÍNAS Principio de funcionamiento del m é todo de Biuret para determinaci ó n de prote í nas. El cobre (Cu 2+ ) se une a los grupos NH de los enlaces pept í dicos, formando un complejo de color violeta

79 Análisis total de proteínas Roolpi, 2002 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

80 CÓMO CONOCER LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA? CONSULTAR Lectura acerca de importancia de las proteínas