CONCEPTO DE HEMOSTASIA Proceso complejo que permite: Prevenir de forma contínua la pérdida espontánea de sangre Detener la hemorragia causada por daños al Sistema Vascular

FASES DE LA HEMOSTASIA Hemostasia primaria: Fase de vasoconstricción parietal: Liberación de factores tisulares de coagulación Fase endotelial-trombocitaria: Activación de plaquetas Resultado: Formación de un tapón inestable de plaquetas (3-5 min)

Proceso Hemostático Vasoconstricción localizada Adhesión plaquetaria Agregación plaquetaria Formación de la malla de Fibrina Activación del Mecanismo Fibrinolítico Hemostasia 1ª Hemostasia 2ª Fibrinólisis

FASES DE LA HEMOSTASIA Coagulación: Fase de formación de trombina: Cascada de activación de enzimas y factores Fase de formación de fibrina: Producción de una red insoluble de proteína Resultado: Estabilización y fijación del coágulo (5-10 min)

FASES DE LA HEMOSTASIA Fibrinolisis: Cicatrización del tejido vascular lesionado Destrucción enzimática de la red de fibrina Resultado: Situación hemostática normal (48-72 horas)

HEMOSTASIA Lesión Endotelial Colágeno Vasoconstricción refleja Plaquetas P. Plasma F III Adhesión Coagulación intrínseca Coagulación extrínseca Liberación Serotonina ADP FIBRINOGENO Agregación Reversible Trombina COAGULO DE FIBRINA Agregación Irreversible Fibrinolisis Fgto. Fibrina TROMBO PLAQUETARIO

RESPUESTA PLAQUETARIA A LA INJURIA VASCULAR

Variable según su ubicación ENDOTELIO VASCULAR MONOCAPA DE CÉLULAS ENDOTELIALES QUE REVISTE LA SUPERFICIE INTERNA DE LOS VASOS SANGUÍNEOS. Variable según su ubicación La integridad del endotelio permite mantener una superficie antitrombótica y anticoagulante.

PARED VASCULAR: Capas Célula endotelial: el endotelio es un órgano activo que participa en la regulación de la hemostasia, del tono y de la permeabilidad vascular. Interviene en la proliferación e inmunidad celulares. Lámina elástica interna fibras de colágeno proteoglicanos fibronectina glicosamiglicanos pocas células musculares lisas Subendotelio: membrana basal elastina microfibrillas

SUSTANCIAS LIBERADAS POR CE Vasoactivas Estimuladoras/Inhibidoras del crecimiento celular Moléculas de adhesión celular Citoquinas proaterogénicas/antiaterogénicas Factores procoagulantes/anticoagulantes

FUNCIONES DEL ENDOTELIO Regulación de la proliferación de las células musculares lisas vasculares Síntesis de sustancias reguladoras del sistema inmune y del mecanismo de inflamación Modula la oxidación lipídica Capacidad para autorregenerarse

SUSTANCIAS VASOACTIVAS Vasodilatadora Óxido Nítrico Prostaciclina Bradiquinina Serotonina Histamina Vasoconstrictora Endotelina Angiotensina II Tromboxano A2 Prostaglandina Ácido Araquidónico

Interacción Endotelio - Plaqueta

CÉLULA ENDOTELIAL VASCULAR (Vasos grandes) NO PGI2 PGE2 t-PA INHIBICIÓN ACTIVACIÓN PLAQUETAS Y LEUCOCITOS INHIBICIÓN TROMBOSIS TROMBOLISIS MANTENIMIENTO DE PERFUSIÓN TISULAR PROTECCIÓN DE PAREDES VASCULARES Y UNIONES ENDOTELIALES

FACTORES HEMOSTÁTICOS Procoagulantes Factor von Willebrand Factor tisular PAF PAI-1 Metaloproteasas Receptores de trombina Anticoagulantes PGI2 t-PA u-PA Trombomodulina GAGS

contiene receptores para LDL 2.- SUPERFICIE NO TROMBOGÉNICA ENDOTELIO NORMAL 1.- BARRERA DE PERMEABILIDAD ALTAMENTE SELECTIVA. contiene receptores para LDL 2.- SUPERFICIE NO TROMBOGÉNICA secreta PGI2 secreta PLASMINÓGENO contiene GAGS

4.-PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO 5.- LIBERACIÓN DE ENDOTELINAS 3.- SECRECIÓN DE vWF (necesario para la adhesión de plaquetas a la pared vascular) 4.-PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO 5.- LIBERACIÓN DE ENDOTELINAS (expresa en la membrana la enzima conversora de Angiotensina I y II) 6.- INTERACCIÓN CON PLAQUETAS, MONOCITOS, MACROFAGOS, LINFOCITOS Y CÉLULAS DE MUSCULO LISO (mediante citoquinas y factores de crecimiento)

Endotelio: Modulador de la Trombogenicidad

ESQUEMA DEL MECANISMO HEMOSTATICO (I) VASO SANGUÍNEO INTACTO (endotelio presente) - Función endotelial normal (superficie vascular tromborresistente) Vasodilatadores (NO) Antigregantes (prostaciclina) Anticoagulantes (trombomodulina, heparina) Fibrinolíticos (activador del plasminógeno –tPA-) - Ausencia de activación de las plaquetas y la coagulación. - No se expresan moléculas de adhesión de leucocitos.

ESQUEMA DEL MECANISMO HEMOSTATICO (I) Vaso sanguíneo lesionado (superficie vascular tromborresistente alterada) Endotelio presente pero con “ función anormal ” Predominio de sustancias “tromboactivas”. - Vasoconstrictores (endotelina, noradrenalina) - Procoagulantes (factor VIII-vW, factor tisular) - Antifibrinolíticos (inhibidor de tPA) Además se expresan moléculas de adhesión. Hay producción de antihemostáticos y vasodilatadores.

ÓXIDO NÍTRICO vasodilatación. inhibición de angiotensina II y de la vasoconstricción simpática. inhibición de la adhesión plaquetaria al endotelio vascular. antiproliferativo, inhibe hiperplasia de las células de músculo liso luego de injuria vascular. elimina al anión superóxido (anti-inflamatorio).

Endotelio: Modulador del Tono vascular

Forastiero et al, Sangre 1999 Monocitos Y 8-epi-PGF2a FR Y b2 GPI VCAM ICAM Y Neutrófilos Y Fosfolípidos Y E-selectina AA Ac. araquid AA Citoquinas Cox2 FcgR Y Y Y Cox1 AA Y FR Radicales libres Plaquetas PGI2 Cox1 TXA2 Y Y Y 8-epi-PGF2a FR Orina Células apoptóticas Y Células endoteliales  11-DH-TXB2  8-epi-PGF2a  2,3-dinor-6-oxo-PGF1a

CINETICA PLAQUETARIA Del total de plaquetas del cuerpo, 2/3 circula por la sangre y el otro 1/3 se deposita en el bazo. Hay intercambio entre las plaquetas sanguíneas y las esplénicas. Hay unas 150.000-400.000/mm3. Su vida media es entre 8 y 12 días. Se destruyen en el hígado y en el bazo, por el SMF.

TROMBOPOYESIS STEM CELL TROMBOPOYETICA CFU mega 1 Meg CSF CFU mega 2 PROMEGACARIOBLASTO MEGACARIOBLASTO PROMEGACARIOCITO MEGACARIOCITO TROMBOPOYETINA PLAQUETAS

Trombopoyesis Megacarioblasto

Promegacariocito

Megacariocito

ESTRUCTURA DE LAS PLAQUETAS Discos biconvexos 3-4 mm de diámetro mayor por 0.5-1 mm de diámetro menor Aspecto liso con aberturas de canales intraplaquetarios

Plaquetas: - pequeñas células anucleadas (diámetro 2 m, volúmen 7-9 fl). - concentración promedio 150 - 400 x 109 / l . - derivan de la fragmentación de los megacariocitos de médula osea. Circulan en condiciones de reposo con apariencia de una lenteja. La integridad funcional del endotelio asegura el estado de reposo gracias a la producción de PGI2 y NO.

FORMACION DE PLAQUETAS MK INMADURO 1-AMPLIFICACION 2-SINT. ORGANELAS 3-SINTESIS. PROT PLAQUETARIAS 4-REORDENAMIENTO MICROTUBULOS 5-FORMACION DE PROPLAQUETAS 6-TRANSPORTE DE ORGANELAS 7-AMPLIFICACION FINAL 8-LIBERACION DE PRO-PLAQUETAS 9-PLAQUETAS 10-APOPTOSIS MK

FORMACION DE PLAQUETAS

ESTRUCTURA A-Membrana Plaquetaria / intra y extra celular. B-Gránulos y organelas intracitoplasmáticas / secreción plaquetaria C-Cito esqueleto / proteínas motoras.

ESTRUCTURA  STD  MP SCA L mitocondrias MICROTUBULOS GLICOG GP IIb-IIIa GP Ib-IX-V MP IIHEMA-ANM

ESTRUCTURA DE LA PLAQUETA

ESTRUCTURA

CITOESQUELETO MICROTUBULOS MALLA DE ACTINA Monomero Globulares Filamentos (G-Actina) (F-Actina) Filamina A (ABP-280), talina, K-actina, miosina I y II MICROTUBULOS  TUBULINA Quinesina y Dineína

CITOESQUELETO

PLAQUETAS Membrana Celular Glicoproteínas, factor plaquetar 3, ácido sialico, fosfolípidos, colesterol y lípidos neutros. No se adhiere al endotelio normal, pero si al lesionado o al colágeno subendotelial. Citoplasma Gránulos densos: Serotonina, ADP, Catecolaminas, Ca++ Gránulosα: Factores de coagulación, PDGF. El contenido de los gránulos se secreta en plaquetas activadas durante la reacción de “LIBERACIÓN”. En ella, la plaqueta se contrae gracias 1.- Actina y miosina. 2.- Trombastenina. 3.- Residuos Rer y aparato de Golgi (almacén Ca++) 4.- Mitocondrias → ATP y ADP

MEMBRANA PLASMATICA Rol fundamental: - mantenimiento de la integridad citoplasmática. - como mediador de las interacciones con proteínas vasculares y plasmáticas. - como mediador de las interacciones intracelulares con los elementos del citoesqueleto. Limita la superficie plaquetaria extendiendo hacia adentro múltiples canales que dan origen al sistema canalicular conectado a superficie. Fosfolípidos: distribución asimétrica, fosfolípidos neutros en la capa externa y los aniónicos en la interna.

MEMBRANA PLASMATICA GP IIb IIIa (Fibrinógeno y vWF) GP Ia IIa GP VI GP Glicoproteínas de membrana: GP Ib-IX-V GP IIb-IIIa (pool externo) GP VI GP Ia-IIa Receptores de activación: de ADP deTrombina deTromboxano A2 de Adrenalina GP IIb IIIa (Fibrinógeno y vWF) Colágeno GP Ia IIa Receptores de activación GP VI GP Ib-V-IX (vWF) Proteínas de 7 dominios de trans-membrana asociadas a proteína G

GRANULOS PLAQUETARIOS  Fg, FV, FP4, vWF, Fn, Tr, Alb, Tp, PDGF  ADP, ATP, Serot, Ca2+ Enzimas Hidroliticas L

GRANULOS PLAQUETARIOS: centralización durante la activación

ESTRUCTURA Y FUNCION DE LAS PLAQUETAS 1. RELACION ESTRUCTURA-FUNCION: MEMBRANA PLAQUETARIA: INTERACCION CON EL EXTERIOR (RECEPTORES) Interacciones con ligandos en la lámina basal del endotelio lesionado Transducción de señales de ligandos circulantes Interacción con otras células de la sangre CITOESQUELETO: CAMBIO DE FORMA Y SECRECION Contracción celular Secreción del contenido de gránulos específicos GRANULOS ESPECIFICOS: ALMACEN DE PRODUCTOS ACTIVOS Moléculas pro-hemostáticas Moléculas pro-cicatrizantes Moléculas activadoras de plaquetas

GLICOPROTEINAS DE LA MEMBRANA PLAQUETARIA 1. FUNCIONES GENERALES: Mediadores de los procesos de adhesión y agregación Receptores para ligandos extracelulares Participación en reconocimiento y fagocitosis Unión de proteínas del complemento Identidad antigénica Mediación de procesos de transporte de membrana Función como enzimas o como antiproteasas Estabilización de la membrana Contribución a la carga de superficie

Glucoproteina Familia gènica Ligando Funciòn GPIIb/IIIa Integrina Fg, vWF,FN,VN Agregaciòn,adhesiòn Receptor de Vitronectina VN, Fg,vWF Adhesiòn GPIc/IIa FN,laminina GPIa/IIa Colàgeno GPIb/IX GP rica en leucina vWF,Trombina Selectina P Selectina PSGL-1 Interacciòn Plq-GB PECAM-1 Ig Interacciòn Plq-Cel GPIV TSP,Colageno

GP IIb-IIIa - pertenece a la familia de las integrinas - es la GP más abundante 40.000-80.000 copias - existe un pool intracelular en las membranas internas - en el estado activo tiene dos sitios de unión para fibrinógeno, también une vWF y fibronectina - la unión a estos ligandos genera una activación adicional de la plaqueta (activación outside-in)

- Extensión: cohesión y secreción Interacción plaqueta-plaqueta. GP IIb-IIIa mediadora de estas interacciones. GP IIb-IIIa pasa de una conformación de baja a una de alta afinidad, como resultado de de los efecto de los agonistas sobre la plaqueta. Ligandos: fibrinógeno,vonWillebrand Fibronectina, vitronectina

INTEGRINAS DE LA MEMBRANA PLAQUETARIA gp Ib: Forma complejos en la membrana plaquetaria con gpIX y citoesqueleto Receptor de contacto con la lámina basal endotelial: factor Von Willebrand Posible receptor de la trombina Es deficiente en los pacientes con Síndrome de Bernard-Soulier gpIa: Receptor de colágeno y fibronectina Complejo gpIIb/IIIa: Su formación es dependiente de Ca 2+ Receptor de fibrinógeno, factor Von Willebrand, fibronectina Implicado en la unión plaqueta-plaqueta en la agregación Diana de tratamientos antiplaquetarios Es deficiente en pacientes con Tromboastenia de Glanzmann gp IV: Posible receptor de colágeno y trombospondina

FUNCION PLAQUETARIA: RECEPTORES DE MEMBRANA

RECEPTORES NO GLICOPROTEICOS DE LA MEMBRANA PLAQUETARIA 1. CLASIFICACION FUNCIONAL: Receptores activadores: ADP, Adrenalina, Colágeno, Serotonina, Trombina, Tromboxano A2 Receptores inhibidores: Prostaglandinas I2 y E1, Prostaglandina D2, Adenosina 2. PAPEL DE LOS LIGANDOS DE RECEPTORES: ADP: Su unión induce la expresión de gpIIb/IIIa Induce la agregación a través de fibrinógeno Inhibe la adenil ciclasa Adrenalina (receptores adrenérgicos): Induce agregación sin cambio de forma Potencia la acción de otros agonistas Tromboxano A2: Induce la movilización de Ca2+ intracelular Prostaglandinas: Inducen la activación de adenil ciclasa El AMPc aumentado inhibe la activación de plaquetas

RECEPTOR DE ADP Agregación Tienopiridines ADP Ca2+ P2Y1 P2TAC P2X1 ? Adenyl cyclase P2X1 ? Gq Gi PLC Shape change Agregación

Adhesion and Aggregation RECEPTOR DE TROMBINA Thrombin Fibrinogen Thrombin receptor Integrin IIb3 Adenyl cyclase   Integrin Activation   -  FAK ATP AMPc  PYK2 PLC PI3K DG IP3 PKC “Src”? Ca2+ Grb2 “Src”? Sos Syk (Tyr kinase) Grb2 Vav Sos Rho Ras PYK2 Grb2 Sos Rac PI3K “Src”? Ras Raf Syk MEK Vav Sos Grb2 ERK1 Rac ERK2 Adhesion and Aggregation ? ? ?

FUNCIONES DE LAS PLAQUETAS Formación del trombo blanco plaquetario. Adhesión Activación Cambios morfológicos Alteraciones de la membrana Estimulación de la síntesis Desgranulación Agregación Almacenamiento y producción de factores. f1p; f2p; f3p; f4p; fibrinógeno; von Willebrand; FV; FXIII; trombostenina.

FORMACIÓN DEL TROMBO BLANCO El proceso se desarrolla en tres fases, con interacción de las plaquetas con la pared del vaso (adhesión), la activación de las mismas y la interacción de las plaquetas entre si (agregación).

ADHESIÓN DE LAS PLAQUETAS Tras la sección de un vaso las primeras plaquetas que escapan se adhieren a las fibras de colageno, a las microfibrillas y al subendotelio. Es rápida (1-2 sg) e irreversible. Este contacto produce la liberación de ADP y con ello la activación de las plaquetas.

ADHESIÒN PLAQUETARIA

ACTIVACIÓN DE LAS PLAQUETAS Cambios morfológicos: tiene lugar la metamorfosis viscosa, con transformación de la forma de disco y aumento de seudópodos. Alteraciones de membrana: formación de receptores que aumenta la agregación. Estimulación de la síntesis. Desgranulación y liberación de sustancias.

cambios morfológicos por activación PLAQUETAS cambios morfológicos por activación 1m   gránulos microfilamentos microtúbulos

AGREGACIÓN DE LAS PLAQUETAS Es un entramado de plaquetas entre si. Este agregado plaquetario es lo que se conoce como trombo blanco. El trombo blanco es inestable y reversible. Para que sea irreversible debe contraerse mediante la trombostenina plaquetaria.

CAMBIO DE FORMA

AGREGACIÒN PLAQUETARIA

Iniciación …SE FORMA UNA MONOCAPA

Liberación de Agonistas ADP y otros activadores son liberados Generación de TXA2 Platelets now begin to release numerous prothrombotic activators with platelet activation becoming highly amplified. Preformed ADP is released from platelet dense granules. Thromboxane A2 is generated from platelet membrane lipids. Both ADP and thromboxane A2 cause further activation and recruitment. This platelet activation leads to aggregation and eventual thrombus formation.   References: Woulfe, D., Yang, J., Brass, L. 2001. ADP and platelets: the end of the beginning. J Clin. Invest. 107: 1503-1505. Thromboxane A2 ADP

Amplificación de la activación Plaquetaria Se acelera la activación … …y se incrementa la agregación. Platelet activation rapidly results in platelet aggregation, a detrimental process, which may progress to thrombosis and acute vessel occlusion with ischemic injury including myocardial infarction and stroke.   References: McNicol, A. and Israels, SJ. 2003. Platelets and Anti-platelet Therapy. J. Pharmacol. Sci. 93: 381-396.

AGREGACIÒN Formación del agregado plaquetario Unactivated platelets are rapidly recruited to the site of injury where glycoprotein mediated binding to the exposed tissue elements stimulates platelet signaling which results in a shape change from the usual disk-like form to spheres with extended pseudopodia, thereby enhancing the ability of the platelets to interact with each other and with the subendothelial surface.   Slide Navigation: You may click on the second image which includes the platelets to view a close up of the shape change the platelet undergoes with activation. Click inside the circle to view an actual photo of activated platelets. References: Gibbons, J.M. 2004. Platelet adhesion signaling and the regulation of thrombus formation. Journal of Cell Science. 117: 3415-3425. EM photo courtesy of Dr. Ogawa at Sankyo Co., Ltd., Tokyo.

- Iniciación: captura, adhesión, activación

Interacción con matriz sub-endotelial Interacción entre vWF y IIb-IIIa permitirá unión estable al sub-endotelio

Interacción con matriz sub-endotelial -25000 copias por plaqueta -receptor del vWf -alta afinidad por el vWf en la plaqueta en estado de reposo -la unión a vWf induce activación plaquetaria -es endocitada cuando la plaqueta se activa

- Iniciación: captura, adhesión, activación

- Extensión: cohesión y secreción

- Perpetuación: estabilización del trombo

- Perpetuación: estabilización del trombo

Mecanismos de amplificación de activación inicial: agonistas solubles y receptores de siete dominios de transmembrana asociados a proteína G.

ACTIVACIÒN PLAQUETARIA Se inicia en la superficie de la cèlula, mediante la interacciòn de un Agonista con su Receptor (GP) Para la interacciòn entre los Receptores de superficie y los Efectores intracelulares ( Adenilciclasa Y Fosfolipasas A2 y C) Se necesitan las Proteinas Reguladoras (Proteinas Gs y Gi) Los agentes que aumentan el AMPc (PGI2 y PGE1) lo hacen a traves de la Gs Los agonistas que inhiben el AMPc ( Trombina y Adrenalina) lo hacen a traves de las Gi La transducciòn de la señal se realiza atraves de 2º mensajeros. Dos vias intracelulares estan implicadas en la activaciòn : La via de los Fosfoinositoles y la via del A.Araquidònico

Woulfe DS, 2005

ACTIVACIÒN -MENSAJEROS INTRACELULARES La uniòn de agonistas a sus receptores de transmenbrana desencadena el metabolismo del fosfatidil inositol a traves dela activaciòn,dependiente de proteina G, de la fosfolipasaC que hidroliza al fosfatidilinositol generando IP3 Y DG que activa la PKC

EFECTORES INTRACELULARES La concentraciòn de Ca2+ :aumenta por acciòn de IP3 y disminuye por aumento de AMPc El aumento de Ca 2+genera la activaciòn de la PKC y activa la fosfolipasa A El DG activa la PKC,promoviendo su traslado del citoplasma a la membrana y aumentando su afinidad por el Ca2+.Esta kinasa cataliza la fosforilacion de residuos de serina y treonina de varias proteinas implicadas en la secreciòn de grànulos a y en la exposiciòn del sitio receptor para el Fg en el complejoGPIIb/IIIa La activaciòn de la PKCes esencial par que ocurra la agregaciòn y secreciòn

Receptores de trombina: GP Ib-V-IX, PAR 1 y PAR 4

EFECTORES INTRACELULARES El AA (presente en las membrana celulares) es el precursor de una flia heterogenea de compuestos con una importante funciòn moduladora La biosintesis de eicosanoides depende de la liberaciòn de AA no esterificado de las membranas fosfolipidicas como consecuencia de la activaciòn de la fosfolipasa A2 por diferentes agonistas. El AA es transformado en intermediarios inestables como PGH2( por la COX) ,en varios hidroperoxidos 5,12, 15HETEs por las correspondientes LOX

Mecanismo de amplificación de señal: síntesis de TROMBOXANO A2 CO PGG 2 PGH2 TROMBOXANO A2/B2 PLC IP3 DAG Ca 2+ PKC TXasa TPa

ESTIMULACIÓN DE LA SÍNTESIS Ac. Araquidónico Tromboxano A2 Vasodilatación Vasoconstricción Movilización del Ca intracitoplasmático Prostaciclinas Prostanglandinas Inhibición de la agregación Estimulo de la agregación Contracción de los trombocitos

Púrpuras Angiopáticas Hereditarias: Telangiectasia Hemorrágica de Rendu-Osler Síndrome de Ehlers-Danlos Adquiridas: Inmunes: Púrpura de Schöenlein-Henoch No Inmunes: Escorbuto Púrpura Senil Enfermedad de Waldestrom Amiloidosis

Púrpuras Trombocitopénicas y Trombocitopáticas Hereditarias: Síndrome TAR Síndrome de Bernard-Soulier (GP IbVIX) Trombastenia de Glanzman (GP IIb IIIa) Enfermedad del Pool de Depósito Adquiridas: Inmunes: PTI – Trombocitopenia Inducida por Heparina No Inmunes: Tratamiento antiagregante CID - Efecto dilucional en politransfundidos Plaquetas grises en circulación extracorpórea Aplasia Medular - Infecciones

Hemorragias cutaneomucosas (Petequias - Equimosis)

Trombocitopenia AUMENTO DE DESTRUCCIÓN, CONSUMO O SECUESTRO PERIFÉRICO Rto de plaquetas < 150x109/L AUMENTO DE DESTRUCCIÓN, CONSUMO O SECUESTRO PERIFÉRICO PRODUCCIÓN DISMINUIDA Hipoplasia megacariocitica Trombocitopoyesis ineficaz ADQUIRIDAS Aplasia medular Hipoplasia QMT o RT Infiltración de MO Drogas Infecciones virales Déficit de vitB12 o fólico Sindromes mieloproliferativos Sindromes mielodisplasicos Hemoglobinuria paroxistica nocturna Alcohol Infección por HIV

Producción disminuida Trombocitopenia Congénitas: Trombocitopenia amegacariocítica Sindrome TAR Sind Wiscott Aldrich Sind May Hegglin Sind Chediack Higashi Sind de plaquetas grises Sind de Bernard Soulier Sind de FAnconi Sind de Alport Epstein Adquiridas: Trombocitopenia ciclica Rto de plaquetas < 150x109/L Producción disminuida Hipoplasia megacariocitica

Producción disminuida Trombocitopenia Rto de plaquetas < 150x109/L Producción disminuida Trombocitopoyesis ineficaz Déficit de vitB12 o fólico Sindromes mieloproliferativos Sindromes mielodisplasicos Hemoglobinuria paroxistica nocturna Alcohol Infección por HIV

Tipo de trombocitopenia Patologìa Mediada por Anticuerpos: Destrucciòn mediada por auto AC Destruccion mediada por aloAC Destrucciòn por vìa RES dependiente de fàmacos mediada por aloAC PTI ,PTI secundaria (asociada a enfermedades linfoproliferativas ,del colàgeno, HIV, MNI Trombocitopenia neonatal aloinmune , purpura postranfusiòn Purpura trombocitopènica inducida por quinina, quinidina,sulfamidas No inmune Activaciòn de plaquetas por via de la trombina o de citocinas Destrucciòn por hemofagocitosis Destrucciòn por mecanismos desconocidos CID ,septicemia ,pancreatitis Sindromes linfoproliferativos malignos, infecciones PTT,SHU

Mecanismo Púrpura trombocitopenica inmune Autoanticuerpos antiplaquetarios Clearence acelerado por los macrófagos por unión fragmento Fc-receptor Disminución de la vida media plaquetaria PLAQUETOPENIA NEJM,2002, mar 28;346(13)995-1008

PTI

Trombocitosis Rto de plaquetas > 400x109/L Trombocitemia primaria Alteraciones del sistema hematopoyético ”Trombocitemia esencial” Trombocitemia primaria Fisiológicas Regeneración sanguínea rápida Asplenia Enfermedades infecciosas e inflamatorias Neoplasias Traumatismo, cirugías, drogas Trombocitemia reactiva

TROMBOCITOSIS I-Sìndromes Mieloproliferativos II-Trombocitosis Secundaria : Enfermedades malignas Enfermedades Inflamatorias Enfermedades del tejido conectivo Infecciones Perdida aguda de sangre Anemia Hemolìtica Cirugìa Respuesta a fàrmacos Respuesta al ejercicio Prematuridad Recuperaciòn de una trombocitopenia

MEGATROMBOCITOS EN SMD

RECUENTO DE PLAQ Y MORFOLOGIA AL MICROSCOPIO OPTICO *Autoanalizadores hematologicos:VPM :6.5-10.5FL ;PDW:15-19 Seudotrombocitopenias y Trombocitosis *Rcto inmunologico por CMF *Rcto por Microscopia : Camara y met Fonio *Morfologia:*Formaciòn de agregados *Anisocitosis *Alteraciones en los grànulos

Recuento de plaquetas IMPEDANCIA Enfoque hidrodinámico

Recuento de plaquetas

INDICES PLAQUETARIOS Los hacen los modernos autoanalizadores. Plaquetocrito. Volumen plaquetario medio. Anchura de distribución plaquetaria.

ANALISIS DE LA FUNCIÒN PLAQUETAR Tiempo de Sangria : *Mètodo de Duke *Mètodo de Ivy ; VN: 3min – 8 min Anormal: trombocitopenias<50 10 9/L , enfermedad de vWF , dèficit de glucoproteinas, defectos en la agregaciòn plaquetarias trombocitopatìas adquiridas , fàrmacos

Tiempo de sangría TS:  sensibilidad -  especificidad -  reproducibilidad Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, “barrido” excesivo

Alteraciones plaquetarias Evaluación Recuento plaquetario normal Tiempo de sangría prolongado ó normal Adhesividad plaquetaria disminuida Enfermedad de von Willebrand Estudio de trastornos plaquetarios cualitativos Congénitos ó adquiridos

In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157) ADHESIVIDAD vW PLAQUETA SUPERFICIE In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157) In Vitro : Mann (colágeno) Hellem II (superficie de vidrio) Scand J Haemat 1970, 7: 37

ADHESIVIDAD: método de Hellen II Sangre entera Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna. Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg. bomba sp EDTA 2% columna cp %Adh = 100- SP- CP SP VN > 27%

PFA-100 Métodos “point of care” Insertar cassette Comenzar el test 2 Comenzar el test 3 Sangre entera (800 µL)

Estudio de la función plaquetaria activación/secreción Estudio de Agregación y Secreción plaquetaria Bernard-Soulier Glanzmann Alteraciones de la activación/secreción Tromboxanos Síntesis Receptores Estudio de gránulos Citometría de Flujo Gránulos densos: Marcación con Mepacrina por Citometría de flujo Gránulos : Fibrinógeno, FvW, Fn intraplaquetarios Disminuido Síndrome de las plaquetas grises Disminuido Déficit de pool de depósito

TECNICAS BIOQUIMICAS FUNCIONALES MORFOLÒGICAS ESPECIFICAS *Agregometrìa : Tècnica Turbidimètrica :Consiste en medir la DO que existe entre un PRP y un PPPal adicionar los agentes agonistas. La respuesta de las plaquetas se puede dividir en 4 fases: Cambio de forma, agregaciòn, movilizaciòn y oxidaciòn del A.A y liberaciòn del contenido de los grànulos. Agonistas :ADP y epinefrina :Curva bifàsica :1º Cambio de forma 2º)Ampliaciòn de la respuesta generada por las sustancias liberadas en la 1ºfase(ADP;TX) Colageno :simula la agregaciòn plq in vivo

Agregación plaquetaria in vitro IIHEMA - ANM Método óptico (Born, 1980) Método potenciométrico (Challen, 1982)

AGREGACION Agonistas panel de rutina: ADR: 10 uM ( adrenérgicos) Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa) AA: 0.5 mM (receptor de Tx) ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12) Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II) Agonistas especiales TRAP6 : PAR1, PAR4 U46619: análogo de TX Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza Ionóforos (A23187): movilización de Calcio

agregación %T inhibición de la agregación tiempo (min)

AGREGACION

Interpretación de la agregación - Cualitativa (semicuantitativa) - Cuantitativa

Recuento de plaquetas: 92.000 / mm3 (en cámara) Macroplaquetas (frotis)

*CMF: Permite analizar la estructura , composiciòn bioquimica y activaciòn Metodologia se basa en el doble marcaje de la muestra.Un anticuerpo unido a un fluorcromo sirve para seleccionar la poblaciòn plq .El 2º anticuerpo unido a otro fluorcromo sirve para marcar el antigeno problema Aplicaciones: Estudio de GP de membrana, actividad procoagulante y activaciòn plq(cambio en la conformaciòn de la GPIIbIIIa , expresiòn de Pselectina

CITOMETRIA DE FLUJO Gráfico de puntos de la dispersión Plaquetas sin estimular Plaquetas estimuladas Gráfico de puntos de la dispersión frontal y lateral de una suspensión de plasma rico en plaquetas Histograma De fluorescencia

MARCACION EN SUPERFICIE TOMA DE MUESTRA: 5 mL de sangre. ANTICOAGULANTE (1:10): citrato de sodio3.8%, EDTA 2%, PFA 1%? PANEL DE MONOCLONALES: ISOTIPO-FITC / PE CD42b ( Ib ), CD41 ( IIb ), CD61 ( IIIa ), CD29 ( Ia ) , CD36 ( GPIV ) 10000 eventos CELL-QUEST IIHEMA-ANM

TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN MARCACION EN SUPERFICIE KG KG MM MM

Sindrome de BERNARD SOULLIER Dispersión frontal- Tamaño (FSH) P: 202 Madre: 65 Control: 47 P CD 42-b (GP Ib) (IMF) P:25 Madre: 171 Control: 257 CD61 (GP IIIa) P: 389 Madre: 176 Control: 167 Paciente Madre Sindrome de BERNARD SOULLIER IIHEMA-ANM

*METODOS ESPECIFICOS PARA EL ESTUDIO DE PLAQUETAS -Glucoproteinas de la membrana plaquetaria: Electroforesis en gel de poliacrilamida, tècnicas de ELISA ,inmunoelectroforesis cruzada -Actividad procoagulante(FP3):por metodo coagulomètricos o sustratos cromogènicos -Liberaciòn del contenido de los grànulos alfa: se evalua B tromboglobulina,FP4,PDGF -Estudio de activaciòn :Ca++por CMF o fluorometria

ACTIVACIÓN PLAQUETARIA DETERMINACIÓN EXPRESIÓN DE P-SELECTINA (CD62P) GPIIbIIIa ACTIVADA (CD41CD61) SECRECIÓN (ATP)

ACTIVACIÓN PLAQUETARIA DETERMINACIÓN

Marcadores de activación plaquetaria: expresión de marcadores de activación en la superficie de la plaqueta (ex vivo) Condiciones analíticas de difícil estandarización: anticoagulantes tiempo de ensayo controles negativos adecuados expresión de resultados (% de eventos positivos, intensidad media de fluorescencia) escasas referencias de CV intra e Inter ensayo CD62P P-selectina % positivos golll IMF

TECNICAS INMUNOHEMATOLOGICAS *Tecnicas de detecciòn de Ac antiplq: -Investigaciòn de AloAc antiplaq: *IFI :permite la detecciòn de los Ac fijados a la membrana de unas plaq de control con la ayuda de una antiglobulina fluorescente, (MO o CMF) * ELISA:Se utiliza antiglobulina marcada con perox para detectar los Ac * MAIPA(inmobilizaciòn de Ag plq por Ac monoclonales especificos) Es mas sensibles que las anteriores

-Investigaciòn de autoAc plaq -Prueba de IFD y IFI:consiste en evidenciar e auto Ac en la membrana de la plaq mediante una antiglobulina humana fluorescente -ELISA ,MAIPA, PAICA(caracterizaciòn de IgG asociada a plaq) TECNICAS PARA LA TIPIFICACIÒN DE AG PLAQ -El analisis del genotipo HPA se realiza mediante tècnicas de biologia molecular

Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria: detección por citometría de flujo Negativo 3 IFM IgG 10 IFM IgM 3 IFM Control normal IgM 31 IFM Negativo 3 IFM IgG 34 IFM Paciente

Drogas que inhiben la función plaquetaria ACIDO ACETIL SALICILICO Inactiva en forma irreversible la ciclooxigenasa plaquetaria y disminuye la formación de Tromboxano A2 » Tpo Sangría: prolonga con variaciones » Agregación plaquetaria: inhibe DIPIRIDAMOL Estimula la adenilciclasa e inhibe la fosfodiesterasa Aumenta el AMP Cíclico » Tpo Sangría: no se modifica » Agregación plaquetaria: no se detectan modificaciones trabajando con PRP

Drogas que inhiben la función plaquetaria CILOSTASOL Inhiben la función plaquetaria actuando sobre los 2º mensajeros. Inhibe la fosfodiesterasa III, exclusiva de las plaquetas y la células musculares. Aumenta el AMPc y baja la concentración de Ca++ citosólico. » Tpo Sangría: lo modifica » Agregación plaquetaria: se inhibe respuesta con ADP CLOPIDOGREL Y TICLOPIDINA Son derivados de las Tienopiridinas. Inhiben la función plaquetaria interfiriendo con el receptor de ADP Inhiben unión FI-GPIIb-IIIa sin modificación estructural » Tpo Sangría: lo modifican » Agregación plaquetaria: se inhibe respuesta con ADP

Drogas que inhiben la función plaquetaria INHIBIDORES DE LA GPIIbIIIa Actúan inhibiendo la unión del FI a la GPIIbIIIa Anticuerpos monoclonales contra GPIIb IIIa: Abciximab (c7E3) Péptidos de secuencia RGD: Heptapéptido cíclico Integrelin. Secuencia Lys-Gly-Asp (RGD) del veneno de víbora barborina. Simuladores de la secuencia RGD: pequeñas moléculas semejantes a las secuencias RGD llamadas Desintegrinas. » Tpo Sangría: pueden prolongarlo » Agregación plaquetaria: pueden inhibir agreg. con ADP